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脑声问答(31)期丨明暗箱实验(LDB)的正确实验方法是什么?

明暗箱实验( light /dark box,LDB)也叫光/暗转换测试,是评价焦虑与抑郁情绪的经典方法,广泛应用于精神神经药理学基础研究:LDB具有较好的结构效度。明暗箱实验可用于研究与情绪障碍相关的疾病模型。明暗箱可用于测试大小鼠的无条件焦虑反应。它基于啮齿动物面对轻度应激源,例如新颖的环境和光线/开放空间时的先天避光和自发探索行为。通过比较正常小鼠和模拟特定疾病(如焦虑症、抑郁症)的小鼠在明暗箱中的行为差异。明暗箱利用啮齿类动物喜欢探究新奇环境,但又因厌恶明室中亮光而被迫退却,由此形成矛盾冲突状态,使穿箱次数减少。抗焦虑药物可显著增加鼠的穿箱次数以及在明室时间。

明暗箱装置示意图

明暗箱(45 cm × 27 cm × 27 cm),木质,包括3部分: 大面积箱体(27 cm × 27 cm × 27 cm),底部分成9个面积相等的方格( 9 cm × 9 cm) ; 小面积箱体(18 cm × 27 cm × 27 cm) ,底部分成6个面积相等的方格( 9 cm × 9 cm) ; 两箱体隔板( 可移动) 之中央通道( 7 cm × 7 cm) 。明箱区采用30 W白灯泡离箱底40 cm高处照明; 暗箱区采用 30 W红灯泡( 或其他实验彩色) 离箱底40 cm高处照明。还有其他的明暗测试箱为灰白色铝合金的封闭测试箱体,箱体内部用隔板分隔成明暗两室,明室顶部装有白光灯,照度可调为0到1200 lux,暗室照度为2 lux,隔板下方有一小门相通。测试箱顶部为控制电路板,顶部中间位置安装有摄像头,摄像头上装有红外截止滤镜,侧面装有红外背景光源 (波长850 nm,侧面平行照射,安装于2倍于鼠身体高度的位置,高度约为 (7-10 cm),底部为不锈钢栅,钢栅下方有用于收集动物的排泄物的活动抽屉。数据分析则采用阈值分割法识别明暗箱中的动物,边缘法计算动物的质心并跟踪动物的运动轨迹,扣除“本底噪音”方式以及阈值法,剔除多种噪声。

实验步骤

操作者将昆明小鼠置于大面积箱体正中央格,用摄像系统记录动物5 min的行为变化,包括两箱停留时间、水平运动、垂直运动、穿梭次数以及粪便粒数; 其中,四只爪子均进入一格方可记录水平运动1次,两前爪腾空或攀 附墙壁方可记录垂直运动1次。操作者将小鼠放入明暗穿梭箱正中格,用摄像 系统记录动物5 min的行为变化,包括两箱停留时间、水平运动、垂直运动; 其中,四只爪子均进入一格方可记录水平运动1次,两前爪腾空或攀附墙壁方可记录垂直运动 1 次。每次实验后,用75%酒精擦拭箱体周壁及地面,以免动物残留物影响下次测试结果。

LDB影响因素

LDB实验条件影响因素主要考察昼夜节律(白天黑夜) 、光照面积(明箱区)、光照颜色(暗箱区)、光照强度(明箱区)以及昼夜节律与光照面积交互效应。其中,昼夜节律主要考察白天周期(18:00 -6:00; Day)、黑夜周期( 6∶00-18: 00; Night) 对实验动物LDB行为模式影响;光照面积主要考察眀箱区光照大面积箱体( L3/5)、小面积箱体(L2/5) 对实验动物LDB行为模式影响;昼夜节律与光照面积采用析因设计分组: Day-L3/5( n = 6) ,Day-L2/5( n = 6),Night-L3/5( n= 6) ,Night-L2/5( n= 6) 。光照颜色主要考察暗箱区光照颜色黄色( Yellow,n = 6) 、绿色( Green,n = 6)、蓝色( Blue,n= 6)、红色(Red,n = 6)对实验动物LDB行为模式影响,明箱区采用30 W白灯泡光照; 实验周期选取Night。光照强度主要考察眀箱区光照强度15 W( n = 6) 、25 W( n = 6) 、40 W( n= 6) 、60 W( n= 6) 、100 W( n= 6) 对实验动物LDB行为模式影响,暗箱区采用30 W红灯泡光照;实验周期选取Night。

光照面积可明显影响LDB焦虑行为模式( Ltime%、Lcross%、Lrear%) ,且光照面积通过昼夜节律影响LD焦虑行为模式,尤其是与明箱区空间面积相比,白天周期 LDB焦虑行为( Lcross%、Lrear%) 明显增加; 光照颜色(黄光)可明显影响 LDB 探索行为模式(Rear),光照强度 (100 W) 可明显影响LDB运动行为模式( Cross、Total)。同时,啮齿类动物情绪行为的形成与表达与先天遗传与后天环 境密切相关,而状态焦虑评价受外界环境及操作条件等 后天因素的影响更为明显,应注意到本研究可能存在的缺陷:昼夜颠倒预适应环境周期仅1 w;光照颜色是通过灯罩颜色过滤获取;光照强度采用灯泡功率大小区分;上 述因素亦可能导致LDB行为模式一定程度的偏移。

统计指标

入明/入暗潜伏期、入明/入暗次数、穿箱次数、明室(暗室) 时间等基本的评价指标; 运动时间、静息时间、明室/暗室运动时间、明室/暗室静息时间、总路程、明室/暗室路程、运动速度等其余判断的指标。纳入实验参数:明区停留时间百分率(Ltime%)、明区水平运动百分率( Lcross%)、明区垂直运动百分率(Lrear%)、水平运动总得分(Cross) 、垂直运 动总得分(Rear)、总得分(Total = Cross +Rear)、穿梭次数 ( Transition)和两区粪便粒数( Lfbs,Dfbs) 及粪便总粒数( Fbs = Lfbs+Dfbs)。小鼠四爪全部通过中央通道才可记录为一次穿梭。

往期推荐

参考文献:

1、Early life genetic, epigenetic and environmental factors shaping emotionality in rodents[J]. Andrew Holmes;;Anne Marie le Guisquet;;Elise Vogel;;Rachel A. Millstein;;Samuel Leman;;Catherine Belzung.Neuroscience and Biobehavioral Reviews,2005

2、王群,马飞,王学斌等.明暗箱实验:昆明小鼠状态焦虑动物模型实验条件筛选[J].中国药理学通报,2022,38(10):1597-1600.

3、50 years of hurdles and hope in anxiolytic drug discovery.[J]. Griebel Guy;;Holmes Andrew.Nature reviews. Drug discovery,2013

4、The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats[J]. M J Castelhano-Carlos;;V Baumans.Laboratory Animals,2009

5、The mouse light/dark box test[J]. Michel Bourin;;Martine Hascoët.European Journal of Pharmacology,2003

6、AB/LAB rats: an animal model of extremes in trait anxiety and depression[J]. Rainer Landgraf.Clinical Neuroscience Research,2003(4)

7、张宏霞,吕静薇,张北月等.一种大小鼠明暗箱图像分析处理系统的研制[J].中国比较医学杂志,2018,28(04):43-49+72.

8、The graded anxiety test: a novel test of murine unconditioned anxiety based on the principles of the elevated plus-maze and light–dark test[J]. Ekrem Dere;;Bianca Topic;;Maria A. De Souza Silva;;Milan Srejic;;Christian Frisch;;Tim Buddenberg;;Joseph P. Huston.Journal of Neuroscience Methods,2002(1)

9、Bourin M, Hascoët M. The mouse light/dark box test. Eur J Pharmacol. 2003 Feb 28;463(1-3):55-65.

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