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将这种Cas9的基因编辑效率提升百倍!诺奖团队重磅Cell论文,找到改进基因编辑的通用策略

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

2012年8月17日,Jennifer DoudnaEmmanulle Charpentier 合作,在Science杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文,成功解析了CRISPR基因编辑的工作原理。仅仅8年后,她们二人获得了2020年度诺贝尔化学奖

而最近,Jennifer Doudna 团队在CRISPR基因编辑领域再获新突破,找到了一种改进CRISPR-Cas9基因编辑活性的通用方法。

2024年5月22日,加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna 教授在Cell 期刊发表了题为:Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9 的研究论文,该研究此前已于2023年12月14日在预印本平台上线。

该研究开发了一种工程化iGeoCas9,其基因编辑效率比野生型GeoCas9高出100倍以上,iGeoCas9增强的基因编辑效率源自三处WED结构域的突变,加速了DNA解螺旋。此外,将类似的WED结构域突变引入其他Cas9酶,也提高了其在细胞中的基因编辑活性。这一发现为对基因编辑酶的改进指明了一种通用策略,揭示了Cas9的WED结构域在DNA解螺旋中的新作用,并证明了加速靶标DNA解螺旋可显著提高Cas9介导的基因组编辑活性。

CRISPR-Cas系统为原核生物提供了适应性免疫功能,通过选择性地靶向并切割入侵病毒和移动遗传元件的核酸来保护自己免受侵害。这种防御机制依赖于CRISPR RNA指导的Cas蛋白来区分外来DNA与内源性DNA。RNA中约20nt的引导序列(guide RNA)使用碱基配对互补性来识别外来DNA靶标,触发其Cas蛋白介导的切割。guide RNA序列的重编程的简便性是CRISPR-Cas系统用于基因组编辑的关键。

来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9是当前最常用的高效基因编辑器,在基础研究、临床治疗和农业应用中已被广泛使用。然而,在体外和体内某些条件下,其对聚集或蛋白水解失活的敏感性可能会抑制基因编辑的结果。

来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的GeoCas9,由于其蛋白寿命更长,曾被认为具有跟更强的基因编辑获刑,但实验证据并为证实这一点。相反,实验结果显示,尽管GeoCas9具有耐热性和良好的生化活性,但在人体细胞中却是一个效率低下的基因编辑器。GeoCas9的高稳定性使其由潜力以核糖核蛋白(RNP)形式递送,但基因编辑效率低的缺点阻止了其作为一种强效基因编辑器。

在这项研究中,研究团队通过基于细菌双质粒选择系统的定向进化,对GeoCas9进行了工程化改造,产生了在培养细胞和小鼠组织中具有改进的编辑活性和扩展的PAM灵活性的GeoCas9变体——iGeoCas9,其在基因编辑效率方面显示出>100倍的增加,其中WED结构域的突变增加了活性,同时保持了热稳定性和蛋白质稳定性。在不同位点上,iGeoCas9与当前最广泛应用的高效基因编辑器SpCas9的基因编辑效率相当。

为了确定iGeoCas9作为基因编辑工具的显著改进的分子基础,研究团队采用冷冻电镜(cryo-EM)和生化分析相结合的方法,比较了野生型GeoCas9与iGeoCas9的结构和行为。

研究团队发现,负责iGeoCas9改进的编辑功能的三处WED结构域的突变,能够与靶向的双链DNA(dsDNA)建立新的相互作用,从而增强DNA结合能力,并放松了与靶序列附近的PAM序列的碱基配对的偏好。 通过荧光报告实验,研究团队发现,改进的dsDNA结合显著加速了DNA解旋,通过减少PAM特异性来扩大了靶序列空间。此外,iGeoCas9 WED结构域突变使其可以在低镁离子浓度的情况下发挥基因编辑功能(相比细菌,哺乳动物细胞镁离子浓度显著更低)。

该研究还发现,将类似的WED结构域突变引入其他Cas9酶——Nme2Cas9,得到的iNme2Cas9同样将其在细胞中的基因编辑效率提升了100倍以上。

这表明了WED结构区域是Cas9靶向识别的关键且以前未被重视的调节因子。这些发现揭示了蛋白质-DNA结合与解螺旋之间意想不到的联系,也为如何通过修改Cas9酶的来增强基因编辑活性提供了新的思路。

论文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00457-4

  • 发表于:
  • 原文链接https://page.om.qq.com/page/OU1LuwntGWaj-DG5LGdS8ilg0
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