氨基酸含量的测定

一、目的

  1.学习茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理及操作方法

  2.了解本方法的应用

二、原理

     茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸脱氨、脱羧，最后茚三酮与反应产物（氨和还原型茚三酮）发生作用，生成紫色物质。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，因此可通过测定反应产物在570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。茚三酮与氨基酸的反应过程如下图所示：

三、 实验仪器及试剂

1．仪器：电子分析天平、722S型分光光度计、电炉、铝锅、25mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、容量瓶(100ml、50ml、10ml)、烧杯、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。

2 .  试剂

（1）标准氨基酸溶液：配制成200μg/mL的溶液。

（2）pH8.04磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾4.5350克定容500ml；称磷酸氢二钠11.9380g定容500ml。取磷酸二氢钾10ml和磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04磷酸缓冲液。

（3）0.2%茚三酮显色液。

（4）样品液：配制每毫升含0.5～50μg 氨基酸的溶液。

四、操作步骤

1. 标准曲线的制作

       取25mL刻度试管6支，从0－5分别编号，按下表加入各种试剂。

      以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制氨基酸标准浓度曲线。

2. 氨基酸样品的测定

      准备2支25mL刻度试管，分别取样品液1mL，加入水3ml，缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，加盖。混匀后于沸水浴中加热15min，冷却定容至25ml，摇匀。放置15min 后测定OD570nm。由标准线性方程求出氨基酸的量。