脑声常谈丨小鼠酒精中毒性脑损伤模型建立与行为评估

动物模型的建立

为了模拟人类酗酒者的每日酒精饮用量，经过体表面积折算，每只小鼠每天的酒精使用量需达到10g/kg及以上。造模过程使用的酒精浓度和实验时长基于预实验的结果，具体动物模型建立过程如下:将56°白酒稀释成5%(v/v)和28%(v/v)两个浓度，模型组小鼠除基础饮用水中含终浓度为5%(v/v)的酒精外，同时灌胃28%(v/v)酒精，前两周灌胃剂量呈梯度增长(从0逐渐增加至6g/kg体重)，随后4周灌胃剂量维持在6g/kg体重，对照组饮用水中不添加酒精同时灌胃等量生理盐水。继6周的建模过程后，所有小鼠接受认知和运动行为学实验包括Y迷宫、Morris水迷宫、爬杆实验和平衡木实验，每个实验之间间隔1～3d，使得动物获得充分的休息。

Fig1 慢性酒精中毒性脑损伤的建模过程和行为学实验时间表

行为学测试方法

1

Y迷宫实验

Y迷宫装置由三个等长水平臂组成(每个臂长40cm，宽10cm，高20cm)，彼此成120°角，从一个中心点向外辐射。简要步骤如下:小鼠被放置在三个臂的中心，在8min的时间里，它们可以自由地出入所有的三个臂。记录进入三个臂的总次数和进入顺序。交替百分比被定义为连续进入三个不同臂的次数/(总次数－2)。

交替百分比可以作为动物空间工作记忆的指标，而进入三个臂的总次数可以作为动物自发运动的指标。

2

Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验参照文献进行并稍有改进。水迷宫宫体直径125cm，高75cm。内壁涂黑，宫体内充满自来水，水温保持在(23±2)℃。逃生平台直径9cm，距离圆周30cm，置于宫体内坐标位置的第一象限。简要步骤如下:整个水迷宫实验包括1d的适应环境，1d的寻找可见平台定位航行，5d的寻找隐藏平台(平台低于水面0.7cm)定位航行和去除平台后1d的空间探索。在定位航行过程中，将自由活动的小鼠分别从四个象限随机放入水中，让其在逃生中寻找平台，若90s后，小鼠仍未找到平台，则引导小鼠找到平台上，并在平台上待15s，每天训练3次;在空间探索过程中，将小鼠从迷宫的固定位置放入水中，让其自由探索60s。小鼠活动通过水池上方固定的摄像头进行图像采集并用VisuTrack软件进行处理。

主要观察指标有:定位航行实验中小鼠找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳速度，空间探索实验中小鼠穿越平台的次数、在平台象限的停留时间和搜索路径。动物在最后1d空间探索实验中的表现可以用来全面评估小鼠的空间记忆能力。

3

平衡木实验

取100cm长、直径1.8cm的圆木棒作为平衡木，平放于地面，两端各一木架支撑(高60cm)。其中一端置一黑色塑料笼，为每次实验小鼠的终点。实验前，训练小鼠从平衡木一端爬行至另一端的塑料笼里，并在笼里待15s，每只小鼠训练6次，训练完毕进行平衡木爬行时间测定。

记录每只小鼠在整根平衡木爬行的总时间，作为动物运动和平衡能力的指标。

5

爬杆实验

将小鼠放在长50cm，直径1.2cm，45°固定的圆木棒上，使肌肉处于静力紧张状态。先引导动物在15s内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕进行爬杆时间测定，记录每只小鼠的爬杆时间，作为动物运动协调能力的指标。

为了进一步对长期过量酗酒所致的脑损伤的病理变化和发病机制有更好的研究，探索建立合适的动物模型至关重要。国内外文献报道的慢性酒精中毒性肝损伤模型和慢性饮酒成瘾/戒断模型及评价已较成熟，而慢性酒精诱导的脑损伤动物模型及评价尚未完善。对于建立慢性酒精中毒性脑损伤动物模型，有一些重要的造模因素需考虑并优化，包括选取的动物种类品系、给予动物酒精的方式、给予酒精的浓度、动物酒精暴露的时间和剂量等。具体模型建立过程中，首先，选取C57BL/6J品系的小鼠作为建立模型的对象，这向该品系小鼠有较高的自愿饮酒量以及对酒精的生理反应与人类非常相似等特征有关。尽管国内外文献也选用过BALB/c、ICR及昆明小鼠作为造模对象，但总体而言，C57BL/6J小鼠是目前研究酒精诱导的器官损伤最常用的动物之一。此外，建立模型过程中，如何给予动物酒精的方式也是需要考虑并优化的。国内外文献报道常见的给酒方式包括口服(含酒精的流质饮食或饮用水)、灌胃、腹腔注射和吸入(暴露于酒精蒸气)。通常，急性饮酒模型采用的是腹腔注射和灌胃方式，而慢性的动物酒精暴露方案采用口服和吸入方式。结合不同给酒方式的优缺点，采用饮水中添加酒精+灌胃法，避免单一给酒方式的局限性，使动物模型尽可能模拟人类慢性饮酒过程并缩短造模时间。

动物模型效度主要由表面效度、结构效度和预测效度组成，其中表面效度指动物模型与临床疾病症状和体征的相似性，结构效度指动物造模过程与临床疾病的致病过程和病理机制的相似性，预测效度指动物模型与临床患者对治疗药物反应的相似性。首先，从表面效度看，模型组体重增长幅度显著降低，日常活动易被噪声惊吓、动作刻板;在认知行为学实验中，模型组在Y迷宫测试中的自发交替率显著降低，在水迷宫空间探索阶段的穿越平台次数和在平台象限停留时间百分比显著降低;在运动行为学实验中，长期酒精暴露会导致小鼠通过平衡木的总时间和爬杆时间显著延长。