动物行为与光电专题㉑丨光遗传技术评估动物焦虑行为

光纤埋置

为了实现对特定环路功能的探究，通过病毒标记结合光遗传调控的方法对PPN和LDT胆碱能神经元的活动进行调控。通过立体定位注射的方法将表达光敏感蛋白的病毒注射到ChAT-Cre小鼠的PPN或者LDT区域。随后进行光纤埋置，将立体定位仪上注射器夹持装置更换为光纤夹持器，将合适长度的光纤（埋置后在颅骨外剩余约0.2mm）固定在夹持装置上，根据病毒标记时的空间位置信息将光纤缓慢插入目标脑区（VP），光纤末端停止在距离目标脑区0.1~0.2mm的地方。由于光纤埋置后小鼠需要恢复以及自由活动，为了避免小鼠日常活动撞掉埋置的光纤，通过埋置微型螺丝辅助固定，使埋置的光纤更加稳定地固定在小鼠头部。使用颅骨钻，以光纤埋置位置为中心呈三角形分布磨出3个浅坑，分别钉入微型螺丝（钉入2~3mm，尽量避免损伤皮层组织），然后使用手术在刀片在颅骨其它位置划出浅痕并在颅骨表面涂抹一层1454胶水。接下来，使用牙科水与牙科水泥搅拌均匀并涂抹在整个暴露的颅骨表面，没过整个钉入的螺丝和部分光纤外置部分，留4~5mm用于实验时连接光纤套管。待牙科水泥凝固后取下实验小鼠，放置在加热垫上使之恢复。

旷场实验和高架十字迷宫实验

旷场实验是用于评价实验动物在环境中自主行为、探究行为与焦虑水平的一种实验方法。实验中使用亚克力板制造旷场实验箱，旷场底部为边长为40cm的正方形，箱子边缘高度为40cm。使用旷场实验来评价激活或者抑制PPN和LDT胆碱能神经元之后小鼠运动能力以及焦虑水平的变化。实验操作在安静的环境下进行，正式实验前先进行适应性训练，即将实验小鼠头部光纤连接上光纤套管并在旷场中自由活动10~15min，每天上午和下午各进行一次，持续3天，使实验小鼠适应实验的抓取以及活动时头部连接的光纤套管。每一次实验或者适应性训练之后使用75%消毒酒精对旷场进行清洗，清除实验小鼠留下的尿液，粪便以及气味等信息，避免对后续实验造成影响。正式实验时，将实验小鼠轻轻地放入箱内底部中心，通过行为记录和分析系统对小鼠的活动进行摄像和计时，小鼠自由活动3min后给予光遗传调控，同时记录小鼠活动，光遗传调控时间为3min，而后实验停止。

高架十字迷宫通过利用啮齿动物对新环境的好奇以及和对高悬敞开环境的恐惧形成矛盾行为来评估动物的焦虑状态。高架十字迷宫有一对开放臂和一对封闭臂，本实验中开放臂由两个长宽分别为25cm和5cm的长方形组成，封闭臂底部与开放臂一致，其中3面是20cm高的挡板围住，开放臂和封闭臂由一个边长为5cm的正方形连接。整个高架十字迷宫由一个高度50cm的支架支撑以保障实验小鼠不会跳出迷宫。实验开始前，预先将实验小鼠在旷场内进行3天适应性训练，让小鼠习惯在头部连接光纤线的情况下活动。实验时，将光纤线连接小鼠头部陶瓷插芯，将小鼠放入高架十字迷宫中心区域，头部朝向封闭臂，当小鼠第一次尝试探索开放臂时对小鼠活动进行记录，3min后给予光遗传调控，光遗传刺激时间为3min，而后实验停止。

光遗传评估小鼠焦虑行为

LDT胆碱能神经元通过调控VTA神经元的活动影响小鼠焦虑行为。为了验证两群投射到VP的胆碱能神经元是否影响小鼠的焦虑情绪，通过高架十字迷宫和旷场来评估调控这些胆碱能神经元的活动时小鼠焦虑水平的变化。

对于旷场实验，将旷场分为16个等大区域，旷场中央的4个区域定义为中心区域。实验中，将小鼠放到旷场中央，自由活动3~5min后开始记录小鼠运动轨迹，记录3min后给予光遗传调控刺激，时间为3min。随后分析光遗传调控前后小鼠在中心区域探索时间的变化。对于高架十字迷宫，实验中将小鼠头部朝向封闭臂放在高架十字迷宫中心区域，当小鼠第一次探索开放臂时记录小鼠活动轨迹，3min自由活动后给予3min光遗传刺激，然后分析比较光遗传调控前后小鼠在开放臂探索的时间。

首先是对PMTVP胆碱能神经元的光遗传激活，473nm的光以20Hz的频率进行光遗传刺激，单个脉冲持续10ms，两个脉冲刺激之间间隔为40ms，光纤末端输出端的激光功率为5mW。结果显示，在旷场实验中，光遗传激活PPNVP或者LDTVP胆碱能神经元时，小鼠在旷场中心区域探索时间与激活前无明显变化。在高架十字迷宫实验中，激活PPNVP胆碱能神经元时，小鼠在开放臂探索的时间没有显著变化，而激活LDTVP胆碱能神经元时小鼠在开放臂探索的时间显著减少。光遗传激活LDT胆碱能神经元对VP的投射时小鼠的焦虑水平上升。

Fig1 光遗传激活LDTVP胆碱能神经元增加小鼠焦虑水平

（A）光遗传激活PMTVP胆碱能神经元前后小鼠在旷场中的运动热度图。（B）光遗传激活PMTVP胆碱能神经元小鼠在高架十字迷宫中的运动热度图。（C）激活PMTVP胆碱能神经元前后小鼠在旷场中心区域探索时间变化。（D）激活PMTVP胆碱能神经元前后小鼠在高架十字迷宫开放臂探索时间变化。一个圆圈代表一只小鼠