从生物体取出组织或器官,经酶的消化或其他方法得到单个细胞,并在体外进行模拟机体培养的细胞,称为原代细胞。原代细胞寿命和代次有限,培养条件需根据细胞类型优化,它与生物相关性高,保留体内组织遗传特性。使用原代细胞能避免动物实验方面的伦理学异议,尽管减少了动物实验的成本,但原代细胞的分离和成本还是很高,在原代细胞培养过程中我们希望尽量减少异常问题的发生。一般问题主要有细胞漂浮、不贴壁、生长缓慢等问题,大部分可以从消化传代、培养基的使用、细胞污染方面考虑。
一、细胞漂浮
1. 操作不当导致贴壁性差或细胞本身贴壁性不强
解决方法:PLL、胶原、0.1%明胶包被,可增强细胞吸附性。
2. 培养器皿:材料表面吸附能力不足
解决方法:使用特殊处理的培养材料。
3. 细胞对温度敏感、预冷收缩
解决方法:将环境维持在25℃以上,培养温度维持在37℃,细胞换液传代过程中预热培养基。细胞停留在培养箱外的时间不能太长,尽量减少拿出拿进培养箱的次数。
4. 血清浓度低、培养液中贴壁因子较少
解决方法:增加血清量,血清含量不低于5%。当然也有部分不需要加血清的细胞,或者加了血清会促进分化的细胞,不适合提高血清浓度。
5. 运输导致细胞聚团脱落
解决方法:保证运输温度在25℃以上,包好缓冲棉减少震荡。温度低,加暖宝宝,温度高加冰袋。
二、细胞传代不贴壁
1. 细胞脆弱、易受损伤,传代过程中吹打离心消化
解决方法:
(1)控制处理过程,4℃或者使用温和的消化酶消化,减少损伤
(2)尽量避免消化后的细胞直接用于实验(可能还有消化酶的残留)
2. 酶消化对细胞表面蛋白损伤
解决方法:降低酶浓度0.05%或者不使用胰酶。
3. 缺少细胞外基质,吸附性不强
解决方法:1)包被接种,PLL、胶原、明胶纤粘蛋白等。2)使用特殊处理材料培养。
4. 诱发细胞凋亡、漂浮
解决方法:更换培养液(培养液配制、储存不当,如pH值过碱,Gln量太少等原因)、调整细胞状态、添加抑制凋亡试剂,比如ROCK 抑制剂等。
5. 传代比例过大,接种细胞数目太少,无法分泌足够的细胞外基质
解决方法:推荐传代比例1传2,细胞传代24小时之内,最好不要晃动,以免影响贴壁。
三、其他常见问题
Q1:如何判断原代细胞衰老了?
A:(1)形态学的观察,细胞突起变大、或细胞扁平;
(2)β半乳糖苷染色判断细胞是否衰老;
(3)增殖速率明显下降;
(4)对相关的标志物进行检测。
Q2:如何确保分离的原代细胞的活性
A:(1)组织离体时间不能太久;
(2)低温冰上分离,但也不能直接从-80℃冰箱上取出一块冰;
(3)无菌操作体系;
(4)消化酶的浓度和消化时间的把控。
Q3:如何让原代细胞一直保持增殖能力?
A:原代细胞传代有限,我们可以通过构建永生化细胞株使其获得无限增殖的能力,即转变为永生化细胞系。
Q4:原代细胞一般第几代做实验比较好?
A:5代以内,3代最好。
Q5:原代细胞可以冻存吗?冻存复苏后活率差的原因是什么?
A:这取决于细胞的类型。一些细胞类型像神经细胞,神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞,不推荐扩增培养和再次冻存。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等,可以扩增培养和再次冻存。然而,需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。冻存后复苏活率低需要考虑冻存前细胞活性,细胞量以及冻存体系,冻存体系是指用的含血清的冻存液,还是一步冻存液,不同冻存方法对应的操作方法不同需要注意。
Q6:贴壁的原代细胞很难消化是怎么回事?
A:细胞初代培养时在细胞皿上培养的时间过长,解决方法可以将酶的浓度降低,37℃培养箱中延长消化时间,或者分步消化。
Q7:提取原代细胞经常发生污染可以怎样改善?
A:首先要确保细胞分离实验室是否存在细菌污染,如果存在问题,需要将实验室进行消毒,培养箱灭菌,检查试剂耗材是否可用,第二个就是注意无菌操作,保证试剂、剪刀镊子等无菌,第三是可以在培养液中加抗生素,双抗、两性霉素等。
海星生物可提供人、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪等近1000多种原代细胞,同时提供原代细胞分离服务,分离不成功不收费。海星生物作为专业的原代细胞研发和服务平台,是您实验研究的放心之选。
作者:海星生物
公众号:海星生物科技
以上内容由海星生物(//www.hycyte.com)提供
我们的服务:CRISPR/Cas9细胞基因编辑、载体构建/病毒包装、分子诊断标准品/突变基因标准品/融合基因标准品、细胞稳转/细胞干扰
我们的产品:HyCyte干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
领取专属 10元无门槛券
私享最新 技术干货