上帝的手术刀

今天给大家带来的文献是最近看到的一篇发在cell stem cell上的比较有意思的文献：CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency。这篇文章通讯作者为清华大学药学院院长丁胜，他是开发和应用全新化学手段研究干细胞和再生医学的引领者，其实验室一直致力于发现和鉴定可以调控细胞命运和功能（例如，不同发育阶段及不同组织中干细胞的维持、激活、分化和重编程）的小分子化合物。他跟北大邓宏魁一样都是化学小分子诱导重编程的领军人物。在这篇文章中，作者阐述了运用CRISPR技术单独诱导内源Oct4/Sox2实现重编程。

iPSC对于再生医学具有很大的希望，通常，研究人员通过构建质粒，使用慢病毒或PiggyBac系统转染，外源引入Yamanaka四因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）介导分化的体细胞重编程为干细胞。这种方法过表达的外源转录因子OSKM会结合在全基因组范围内它们调控的位点，并最终重组基因的表达，介导向多能性调控网络的转化。但是，在这一过程中内源的染色质是在表观上如何重建以使细胞向多能性转化的，而向iPSC细胞的诱导是否必须有大量的多能性相关位点的重建（组蛋白修饰），是否单一位点的重建足够使iPSC的诱导成为可能，这些问题尚不清楚。最近一篇文章利用ATAC-seq也证实过，表观遗传的重构是细胞重编程的中心机制(Chromatin Accessibility Dynamics during iPSC Reprogramming)。但也尚没有研究机构证实能够通过直接的表观遗传技术操纵内源基因座启动从而诱导重编程。

近年来大火的CRISPR/Cas9系统的确是哺乳动物细胞中基因编辑的有力工具，而CRISPRa系统则是使原始切割DNA的功能序列Cas9失活，保留其位点识别功能，并与反式激活结构域结合从而设计为可编程的合成转录因子。这一系统可作为高精度定位沉默染色质位点的先驱因子，并将其从沉默变为活化，促进下游基因转录。而也有研究人员发现dCas9-p300可用于操纵基因组靶位点的组蛋白乙酰化(p300为组蛋白乙酰转移酶)。有了这些功能，CRISPRa系统成为了能够精确地改造特定内源基因的有力工具。

为了探索是否表观性改变内源基因的活性是否能够实现对分化细胞的重编程，文章使用CRSPRa系统精确重塑MEF细胞中的内源多能性基因位点。构建dCas9-Sun-Tag-VP64质粒，VP64为转录激活因子，通过招募多种表观遗传修饰因子促进基因转录和染色质重构(组蛋白修饰)。将多个VP64募集到一个靶向位点来增强其染色质重塑活性，dCas9表达则由Tet-On启动子（加入dox后诱导表达）控制。由于Oct4和Sox2在多能性诱导和维持中处于核心地位，因此二者被选作靶标。在dox诱导四天后，作者观察到靶向Oct4启动子能导致其转录强度增加约100倍，而靶向增强子则能使其适度活化。而对于靶向Sox2启动子，能检测到约15倍的激活。因此这些实验表明在特定的sgRNAs的指导下，dCas9-SunTag-VP64可以激活MEF中沉默的Oct4和Sox2.

文章最后指出了直接重塑内源性Oct4或Sox2的表达足以触发MEF细胞重编程为多能性干细胞，这不仅为iPSC的产生提供了另一种方式，而且为多能性诱导的分子机制提供了独到的见解。例如，在文章对Sox的研究证明，内源性Sox2的激活是多能性诱导的关键事件，这与先前的研究部分一致，内源性Sox2的激活标志着多能性的确定性阶段（Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase）。而在文章对Oct4的研究中发现，增强子区域的重塑是多能性转化所必需的，特别对于后期细胞的进一步诱导（如图）。这一现象表明Oct4启动子起到快速触发的作用，并且增强子是潜在但引发Oct4转录后期增强所必需的调节因子。而这也引发了一个问题，增强子的染色质重构是否促进了小鼠胚胎干细胞中启动子-增强子循环的有效建立？这仍需要进一步的研究探索。另外，虽然文章对能否诱导进行了验证，但文章中也提到，这一诱导效率较低，并且在同一转染条件下异质性较大，这可能由于SunTag组分的失效或质粒整合的拷贝数较低导致，尽量减少这一问题能达到0.1%的诱导效率。这些也是之后需要考虑和解决的问题。另外，作者也提到在转染后将Parnate，Chir99021，A83-01和Forskolin（PCAF）组成的小分子混合物添加到培养基中，能够有效增加Oct4和Sox2转录活性，增加诱导效率。

本文作者为Email-Journal Club （EJC）的成员之一。在这里也介绍一下EJC，EJC在2018年2月28日正式成立，我们这个小团体集聚了各个领域的同学。EJC的存在不仅是督促我们对自己领域核心技术的不断钻研和反复思索，对领域热点难点的持续追踪，更重要的是促进我们对各个领域的了解和认识。希望这个组织能够在科研的道路上陪伴我们很久，也希望我们互相督促、互相勉励、共同成长。

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