Adv Sci | SIRT5介导去琥珀酰化在镉诱导的类阿尔茨海默症中的作用与进展

景杰生物 | 报道

随着环境污染的加剧，重金属镉（Cd）的暴露已成为一个严重的公共卫生问题。镉不仅对环境造成破坏，还对人体健康，尤其是神经系统产生严重影响。研究表明，重金属环境污染物镉暴露与阿尔茨海默病（AD）的发展有关，其可以穿过血脑屏障，最终在大脑中积累并引起神经毒性，从而促进阿尔茨海默症(AD)的进展。先前研究发现，AD的发病机制也与自噬受损有关。此外，SIRT5是蛋白质去乙酰化酶sirtuin家族的一员，参与调控AD、PD等多种脑部疾病，SIRT5也可以破坏自噬膜的形成来阻断自噬流，但SIRT5在镉暴露诱导的AD进展的自噬过程中的确切作用和潜在机制仍然不清楚。

2024年6月5日，三医大余争平教授/皮会丰副教授团队和重庆大学周舟教授团队在Advanced Science（IF=15.1）发表了题为“SIRT5-Mediated Desuccinylation of RAB7A Protects Against Cadmium-Induced Alzheimer's Disease-Like Pathology by Restoring Autophagic Flux”的研究论文。该研究发现神经细胞的镉暴露显著抑制SIRT5的表达，利用琥珀酰化修饰组学发现SIRT5表达降低会导致溶酶体 Ras 相关蛋白 7a（RAB7A）的琥珀酰化修饰增加，从而降低RAB7A的活性，阻碍其向溶酶体蛋白（RILP）募集，导致自噬流被阻断，最终导致认知能力下降并促进AD病理进展。景杰生物为该研究提供了琥珀酰化修饰组学技术、琥珀酰化泛抗体偶联树脂、定制琥珀酰化修饰位点抗体支持。

1. SIRT5参与镉诱导的Neuro-2a细胞淀粉样蛋白-𝛽前体蛋白（APP）积累和自噬流阻断

作者首先发现镉处理后小鼠脑神经细胞Neuro-2a细胞的活性显著下降，而细胞中APP的表达则显著上调。此外，用镉处理前后的Neuro-2a细胞进行蛋白质组学检测，发现处理后Neuro-2a细胞中自噬相关蛋白表达明显升高。然后作者通过实验证明了镉抑制了自噬小体-溶酶体融合以及溶酶体功能，从而诱导自噬流阻滞并加剧了APP的积累。对蛋白组数据进行独创性通路分析（IPA），发现sirtuin信号通路排名前十，并且分子相互作用网络发现APP的上调和SIRT5水平的降低之间存在显著的相关性，表明SIRT5可能在APP的积累中发挥重要作用。后续，作者通过实验发现在Cd处理的Neuro-2a细胞中，SIRT5的蛋白水平呈剂量依赖性地下降，且SIRT5能通过其去酰化活性增强自噬来减轻镉的神经毒性作用。

图1、SIRT5依赖的去乙酰化酶活性在镉诱导的APP积累和神经细胞死亡中过程起重要作用

2. K31位RAB7A去琥珀酰化拮抗Cd诱导的自噬通量阻断和神经毒性

作者考虑到SIRT5具有较强的去琥珀酰化酶活性，为了进一步确定镉处理后显著改变的赖氨酸琥珀酰化蛋白及位点，于是作者对镉处理前后的Neuro-2a细胞进行了琥珀酰化修饰组学检测，KEGG结果表明AD途径排名前二十。从GO富集结果中选择自噬-溶酶体机制相关蛋白进一步研究，发现溶酶体 Ras 相关蛋白 7a（RAB7A）是唯一一个与所有选定的GO项重叠的基因，因此作者猜测RAB7A在Cd诱导的自噬通量阻断中可能发挥了关键作用。琥珀酰化修饰组学显示， RAB7A具有一个赖氨酸修饰位点Lys31(K31)，该位点在多物种中高度保守。随后，作者利用景杰生物提供的RAB7A K31su定制抗体进行了验证，发现在Cd处理后Neuro-2a细胞中RAB7A K31的琥珀酰化修饰水平显著上调。然后作者又通过分子生化实验进一步研究该位点的功能，发现RAB7A的K31位点去琥珀酰化修饰后可以消除Cd诱导的自噬流阻断和神经毒性。

图2 在镉暴露的Neuro-2a细胞中，RAB7A的K31位点琥珀酰化修饰水平上调

3. 镉暴露的Neuro-2a细胞中SIRT5促进RAB7A去琥珀酰化并增强其活性

为了确定SIRT5是否调控RAB7A中的K31位点去琥珀酰化并调节RAB7A的功能，作者首先利用分子对接、微量热电泳法以及表面等离子体共振分析等方法验证了SIRT5与RAB7A的直接互作，值得注意的是在RAB7A的Lys31和SIRT5的Tyr255之间观察到了氢键的形成；然后作者利用景杰生物提供的琥珀酰化修饰位点特异性抗体进行相关实验，发现SIRT5使RAB7A的K31位点去琥珀酰化，从而调节了镉处理的Neuro2a细胞中RAB7A的活性。

图3 SIRT5在Lys31位点与RAB7A相互作用使其去琥珀酰化，并拮抗镉抑制的RAB7A活性

4. SIRT5的表型验证及其临床相关性

接下来，作者在FAD4T小鼠中验证SIRT5对AD进展的影响，通过行为评估发现与对照组相比镉诱导的FAD4T小鼠表现出显著的空间学习和记忆的障碍，而过表达SIRT5则显著挽救了镉诱导的FAD4T小鼠的这些缺陷。此外过表达SIRT5也能影响小鼠大脑中A𝛽负荷、大脑皮层和海马区APP表达以及RAB7A K31的琥珀酰化修饰水平，同时也影响了细胞的自噬过程，这些结果强调了SIRT5-RAB7A轴在体内的潜在神经保护作用。因此SIRT5可以作为一个有希望的治疗靶点以减轻镉暴露的FAD4T小鼠的空间学习和记忆障碍。

进一步地，为了确定SIRT5的临床相关性，作者从GSE188545数据库中下载了AD患者和健康对照组(HC)死后冰冻人脑组织的原始 SnRNA-seq数据。通过研究已知基因标记的表达模式，进一步对人脑中的细胞群体进行了分类，并对主要细胞类型进行了注释，其中包括神经元(NRGN、CAMK2A和GAD1) 的表达模式。GO分析进一步评估差异表达基因对神经元的潜在影响，发现神经元中的差异表达基因（DEGs）在与AD相关的方面显著丰富，如学习或记忆、认知和淀粉样前体蛋白代谢过程。有趣的是，小提琴图显示SIRT5在神经元中的表达水平高于其他类型的细胞。除此之外，与对照组相比，AD患者大脑中神经元的SIRT5水平明显降低，而其他细胞类型中的SIRT5水平改变不明显。

图4 AD患者脑神经元中的SIRT5水平明显低于健康对照组

综上所述，本研究旨在通过琥珀酰化修饰组学探讨自噬在环境镉诱导AD进展中的作用及其机制，即镉暴露抑制了SIRT5的表达，进而增加了RAB7A的K31位的琥珀酰化修饰，抑制了RAB7A的活性，从而导致自噬流受阻。重要的是，SIRT5的过表达通过降低RAB7A琥珀酰化修饰水平，可恢复受阻的自噬流，减轻A𝜷沉积和记忆障碍。

图5 研究模式图

值得一提的是，琥珀酰化修饰是近年来被广为关注的新型蛋白质翻译后修饰类型，而本文的发现进一步扩大了我们对其诱导疾病发病机制的理解，也证实了增强SIRT5表达的干预措施在治疗Cd加重的FAD4T小鼠疾病进展中的有效性，从而确定了一种与环境相关的有毒金属相关的AD的新治疗方法，具有重大的科学价值和潜在的临床意义。除此之外，还有其他新型酰化修饰类型及蛋白质组学也广泛运用到了阿尔茨海默病的发病机制探究中，并取得了不错的研究进展。例如：美国斯坦福大学研究团队通过对阿尔茨海默病患者的4种不同脑区的组织样本进行空间蛋白质组学分析，最终揭示了5个阿尔茨海默症的治疗新靶点（点击链接详细阅读：Nat Commun | 脑组织的空间蛋白质组揭示阿尔茨海默症的治疗新靶点）；华中科技大学同济医学院的王建枝/杨莹教授团队发现IDH3β-乳酸化修饰可以加速AD进程（点击链接详细阅读：STTT | 华中大王建枝/杨莹团队揭示IDH3β-乳酸化修饰加速AD进程新机制）；袁增强/孙露洋团队发现小胶质细胞 “糖酵解-组蛋白乳酸化-PKM2” 正反馈环路在AD发生发展中发挥重要调控作用，且可作为干预靶点（点击链接详细阅读：Cell Metab | 袁增强/孙露洋团队联合揭示组蛋白乳酸化驱动阿尔茨海默症发生）。这些案例均提示了新型酰化修饰及蛋白质组学对于包括阿尔茨海默病在内的神经性疾病的巨大研究潜力。

文中所用景杰抗体产品列表如下：

参考文献：

Deng P, et al. 2024. SIRT5-Mediated Desuccinylation of RAB7A Protects Against Cadmium-Induced Alzheimer's Disease-Like Pathology by Restoring Autophagic Flux. Adv Sci (Weinh).