Science子刊：陈正一团队开发靶向miRNA的基因编辑疗法，治疗遗传性耳聋

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

听力损失是一种多因素疾病，在全世界范围内影响着数千万人。导致听力损失的单基因突变占所有先天性感音神经性听力损失的 50%以上，然而目前尚无获批的药物或生物疗法来减缓或逆转遗传性耳聋。

在这些耳聋相关基因中，miRNA是一类短的（约20-24nt）内源性非编码RNA，它们在蛋白质编码基因表达调控中发挥关键作用，被认为是内耳发育的重要因素，也是正常听力所必需的。具体而言，MIR96（miR-96）突变已被确定为人类和小鼠常染色体显性遗传非综合征型耳聋50型（DFNA50）的致病因素。

2024年7月10日，哈佛大学医学院陈正一教授团队在 Science 子刊 Science Translational Medicine 上发表了题为：Targeted genome editing restores auditory function in adult mice with progressive hearing loss caused by a human microRNA mutation 的研究论文。

该研究优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统，以特异性清除MIR96突变，使用腺相关病毒（AAV）将该基因编辑系统递送至携带Mir9614C＞A突变的成年小鼠耳蜗中，在听力损失症状出现前和出现后均可促进毛细胞存活并改善听力。这些结果表明，靶向编辑miRNA可能是一种保护DFNA50患者听力的有潜力的新策略。

MIR96在内耳的感觉细胞中特异性表达，通过降低多个靶基因的mRNA的表达，在耳蜗发育和听力维持中发挥关键作用。MIR96种子区域的点突变会导致人类家族中具有显性遗传模式的进行性听力损失。在小鼠中的研究表明Mir96对正常毛细胞发育是必需的，而Mir96突变之所以导致听力损失，是因为其突变后产生了新的靶基因，而不是因为功能丧失，因此，不能通过导入正确的Mir96来进行治疗。

针对显性MIR96突变，基因组编辑技术显示出了巨大前景。此前，通过递送CRISPR-Cas9基因编辑系统，已在多种听力损失疾病小鼠模型中证明了破坏显性等位基因的有效性。刘如谦团队也证实了碱基编辑可以修复耳聋小鼠模型的Tmc1基因显性突变。

在所有关于遗传性听力损失的基因编辑研究中，干预都是在耳蜗未成熟的新生小鼠中进行的。相比之下，人类新生儿的内耳是完全发育的，小鼠耳蜗从新生到成年阶段会经历发育变化，包括大小、结构和功能的变化。这种差异突出了需要评估成熟耳蜗中基因组编辑治疗的疗效、安全性和时间窗口，以确定潜在临床应用干预的可行性。

在这项研究中，研究团队通过非同源DNA末端连接（NHEJ）进行编辑，以在患有听力损失的年轻成年小鼠中靶向显性Mir96突变（Mir96tm3.1Wtsi，在该研究中称为 Mir9614C＞A），通过腺相关病毒（AAV）进行递送。实验结果表明，AAV介导的基因编辑复合物的递送具有良好的耐受性，且不会损害正常听力。

研究团队筛选了不同的基因编辑器，并确定了一个优化的编辑器，从而在体外和体内实现了高效且特异性的基因编辑。研究团队在听力损失发生之前和之后测试了干预措施，并确定了治疗能使听力持续保持的时间窗口。

具体来说，使用AAV2递送saCas9的KKH变体（SaCas9-KKH）和sgRNA，在听力损失发生前（3周龄）和听力损失发生后（6周龄）的成年Mir9614C>A/+突变小鼠中均长期改善了听力，在3周时治疗效果更好。

AAV2-SaCas9-KKH-sgRNA4递送到成年Mir9614C>A/+小鼠的耳蜗中，可促进毛细胞存活以及维持静纤毛的完整性

为了提高编辑策略的安全性，研究团队确定了在未检测到AAV整合的剂量范围，结果显示，SaCas9-KKH的瞬时表达在注射12周后结束，没有发现AAV基因组整合的证据，表明这种体内基因组编辑策略的安全性良好。

由于人类和小鼠的Mir96在种子区域的序列100%相同，研究团队开发了一种双AAV系统，携带了靶向目前所有已知的人类MIR96突变的sgRNA，从而能够靶向多种MIR96突变，为其潜在的推广和广泛应用提供了证据。

携带多个sgRNA的双AAV系统，可有效靶向人类细胞中所有已知的MIR96种子区突变

总的来说，该研究确立了体内基因组编辑作为治疗成年动物基因突变引起的听力损失的可行方法的可行性。为开发由MIR96突变引起的DFNA50患者的治疗方法奠定了基础。

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