动物行为与光电专题（35）丨光纤记录动物刻板行为

行为学实验与轨迹记录

在进行行为学实验前，对小鼠进行3d的限食和环境适应，控制其体质量为初始体质量的85％，并在正式训练前每天抚触小鼠5～10min，以防止正式训练时小鼠应激。设置长、宽、高分别为30cm×30cm×30cm或50cm×50cm×30cm的空旷场，在4个壁上粘贴不同图案（星形、三角形、正方形、圆形）。每次实验前，用75％酒精擦拭环境，消除食物气味对小鼠探索新环境的干扰。正式训练过程中，每次从旷场的同一方位放入小鼠，通过Cineplex v2／v3软件（Plexon，采样频率：30Hz）联合头顶摄像头记录小鼠在空旷场中自由探索10min的运动轨迹和行为。

轨迹分析与行为学检测

追踪视频数据导入MATLAB软件程序，通过识别小鼠身体较低的灰度值（暗，阈值设置0～30）与旷场背景（亮）之间的对比度，追踪得到小鼠运动轨迹数据。设置速度阈值为3cm／s，低于速度阈值判断为静止状态，记录小鼠的运动和静止时间，并分析投射到MEC的RE神经元钙信号与速度之间的相关性。根据视频判断并手动记录小鼠站立、抬头、理毛行为的时间，导入到MATLAB程序，分析行为事件期间的钙信号，并做相关性分析。为了研究干预RE-MEC通路是否会对小鼠的焦虑程度产生影响，进而影响到小鼠探索的行为表现，分析小鼠在中央区（用MATLAＢ对旷场底部以4×4方式划分为16个小的正方形，中心的4个小格为中央区）的停留时间。

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光纤记录与分析

小鼠麻醉固定，暴露颅骨，调平后，定位RE和MEC位置。在RE脑区注射200 nL AAV2／9-CAG-FLEX-jGCaMp7b病毒载体，在两侧MEC分别注射200 nL AAV2/2Retro-hSyn-Cre病毒载体，注射完毕后缓慢拔出，消毒缝合。病毒表达3周，进行光纤埋置手术。在小鼠颅骨表面定位6个骨窗位置，坐标分别为（AP＝＋1．50mm；ML＝±1．50mm），（AP＝－3．00mm；ML＝±2．00mm），（AP＝－6．00mm；ML＝±2．00mm），用于埋置螺丝。定位RE脑区，坐标不变，缓慢植入光纤，并于目标位置上方约0．5mm处开始实时探测钙信号，当幅值到达最大值且平稳后，停止植入，牙科水泥固定光纤。术后恢复7d，将小鼠放入30cm×30cm的空旷场进行空间探索任务，使用光纤记录系统记录投射至MEC的RE神经元钙信号（410nm发光强度：10～20μＷ，470nm发光强度：20～40μＷ，采样频率：20Hz），校正处理后得到ΔF／F表征钙信号变化情况。

化学遗传干预实验

为了观察特异性抑制RE-MEC通路对空间探索行为的影响，将16只同一批C57BL／6J小鼠按随机数字表法分为2组。小鼠麻醉固定，定位RE和MEC，在RE脑区注射200 nL AAV2／9-EF1α-DIO-hM4d-mCherry或对照病毒AAV2／9-EF1α-DIO-mCherry，在两侧MEC分别注射200 nL AAV2/2Retro-hSyn-Cre病毒载体，注射完毕后缓慢拔出，消毒缝合。病毒表达3周，进行导管埋置手术。埋置6颗螺丝，定位RE脑区，缓慢埋置导管，植入深度约为4．35～4．40mm，牙科水泥固定导管。术后恢复7d，小鼠进行空旷场空间探索任务。旷场训练前15min，使用微量注射泵经给药导管于RE脑区给予200 nL CNO（5 μ mol/L，注射速度为100 nL／min）。手术恢复1周后，记录小鼠在空旷场中探索10min的行为和神经元钙信号活动。分析特异性投射至MEC的RE神经元在探索行为和刻板行为期间的钙信号活动。

在体情况下RE-MEC通路在小鼠进行空间探索时的活动特征。分析小鼠在空旷场中自由探索的一系列行为谱，包括探索行为（站立行为、抬头行为），刻板行为（理毛行为）、运动和静止状态，记录了这些行为期间投射至MEC的RE神经元的活动模式。

投射至MEC的RE神经元在空间探索相关行为中激活