【文献解读】CRISPR KO筛选助力开发眼镜蛇毒液咬伤的潜在解毒剂

眼镜蛇毒液咬伤是一种严重的医疗紧急情况，因为其毒素可以迅速影响神经系统、血液系统和组织。在治疗眼镜蛇毒液咬伤时，寻找有效的解毒剂是至关重要的。近年来，研究人员在探索潜在的解毒剂方面取得了一些进展。例如，某些天然植物提取物、抗毒素血清以及合成的药物都被评估为潜在的解毒剂。这些解毒剂通过中和毒素、阻断毒素的作用或促进毒素的排泄来帮助减轻伤害。尽管目前还没有完全理想的解毒剂，但科学家们的持续研究为未来可能的治疗方法提供了希望。

今年七月，悉尼大学、利物浦热带医学院、哥斯达黎加大学等机构的研究人员联合在Science子刊Science Translational Medicine（1区Top，if：17.1）期刊上发表题为Molecular dissection of cobra venom highlights heparinoids as an antidote for spitting cobra envenoming的研究论文。蛇咬伤每年影响约180万人。目前的治疗标准涉及基于抗体的抗蛇毒血清，这种抗蛇毒血清可能难以获得，并且通常对局部组织损伤无效，而局部组织损伤是发病的主要原因。研究人员利用全基因组CRISPR基因筛选发现了多种影响细胞对眼镜蛇毒液反应的关键基因，包括EXT1、B4GALT7、EXT2、EXTL3、XYLT2、NDST1和SLC35B2，研究人员对此进行了独立验证，发现肝素类药物可能是抑制剂，这表明这类药物可以作为吐出眼镜蛇毒液的潜在疗法。

据调查，蛇咬伤每年导致138,000人死亡，400,000人长期患病，尤其影响撒哈拉以南非洲和南亚地区的年轻人和儿童。作为最致命的被忽视热带疾病之一，蛇咬伤严重负担主要集中在贫困农村社区，西非和东南亚的疾病负担高达数十亿美元。为应对这一危机，世界卫生组织已将其提升为“优先 A 类被忽视的热带病”，并设定了到2030年减半全球蛇咬伤负担的目标。现有的抗蛇毒血清虽能挽救生命，却昂贵且对局部组织损伤无效。为此，研究人员利用功能基因组学方法来定义毒液-靶向基因相互作用，这些相互作用改变了由吐出眼镜蛇毒液引起的细胞毒性，利用这些信息来开发一种局部作用的毒液解毒剂。

一、全基因组CRISPR基因敲除筛选眼镜蛇毒液的细胞毒性

研究人员首先测试了来自撒哈拉以南非洲的红蛇毒液（Naja pallida，坦桑尼亚）和黑颈蛇（Naja nigricollis，尼日利亚）吐出眼镜蛇毒液对人单倍体细胞系HAP1的细胞毒性。额外的药理学抑制通过caspase-3抑制剂Ac-DEVD-Cho或 pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK，结果发现并未抑制毒蛇毒素的细胞毒性。然而，坏死性凋亡抑制剂Necrosulfonamide限制了一些细胞死亡，表明眼镜蛇毒液的细胞毒性可能部分引发坏死性凋亡死亡。

为了指导治疗药物的发展，研究人员使用全基因组 CRISPR 基因敲除筛选来研究蛇毒引起的细胞死亡的分子机制。通过使用 TKOv3 文库转导 HAP1 细胞，靶向大多数人类蛋白编码基因，并用苍白猪笼草和黑颈奈瑟菌毒液蛇毒处理细胞，筛选出对毒液敏感和耐药的基因。苍白猪笼草和黑颈奈瑟菌毒液的细胞毒性机制主要涉及到特定的基因和生物合成途径，尤其是肝素/硫酸肝素的生物合成。而关键的生物合成途径则包括硫酸肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的合成。结果表明，单独靶向大部分肝素/硫酸肝素生物合成途径成分足以阻断毒液活性。

图1 体外全基因组 CRISPR-Cas9 KO 筛选确定非洲喷毒眼镜蛇毒液细胞毒性所需基因

二、肝素的生物合成是毒液细胞毒性的必要条件

为了进一步验证肝素/硫酸肝素生物合成途径成分阻断毒液活性能力，研究人员通过针对肝素/硫酸肝素生物合成途径中的不同基因，生成了一系列的基因敲除细胞池，并测试了这些细胞对毒液的反应性。结果证实了肝素在眼镜蛇毒液细胞毒性中的作用。随后，研究人员使用来自不同地区的眼镜蛇（N.nigricollis，坦桑尼亚）毒液处理这些基因敲除细胞，结果再次表明，表明肝素/硫酸肝素生物合成的成分是细胞毒性所必需的。

图2 硫酸乙酰肝素的生物合成是喷毒眼镜蛇毒液细胞毒性所必需的

肝素和硫酸肝素共享一个通过共同途径合成的糖骨架。硫酸乙酰肝素是细胞外基质中普遍存在的成分，而肝素主要由组织肥大细胞产生。肝素是一种高度硫酸化的聚阴离子多糖，因其有效的抗凝血活性而被临床上使用。为了验证这一点，研究人员还使用类肝素，如肝素、丁扎肝素或达肝素，研究发现，过量的肝素或低分子量肝素可以有效阻断毒液的细胞毒性，这些药物同样对不同种类的毒液具有抑制效果。此外，研究人员用黑颈奈瑟菌毒液处理细胞，结果确证了肝素或丁扎肝素治疗也可以阻断苍白奈瑟菌和坦桑尼亚黑颈奈瑟菌毒液后的细胞毒性。

图3 肝素和 LMW 类肝素在体外阻断 Naja 毒液的作用

三、肝素类药物可防止毒液与细胞表面相互作用

硫酸乙酰肝素及其类似物能够作为毒液解毒剂，通过充当“诱饵”受体来阻断眼镜蛇毒液与宿主细胞的相互作用。进一步验证发现，标记的眼镜蛇毒液与未处理细胞有强烈的结合，而添加硫酸乙酰肝素或汀扎肝素后，这种结合显著减少，阻断了毒液的细胞毒性作用。该结论在不同地理变体的眼镜蛇毒液中也得到了验证。结果表明，游离肝素可以抑制毒液-靶向相互作用，这足以阻断细胞毒性。

图4 肝素结合 3FTxs 并防止其细胞毒性

四、肝素与三指细胞毒素相互作用，阻断毒液与宿主的相互作用

眼镜蛇毒液主要由磷脂酶A2（PLA2）和三指细胞毒素（3FTxs）组成。研究人员通过肝素亲和色谱法分离了不同种类的眼镜蛇毒液，并用液相色谱-质谱法鉴定了各个主要蛋白质的组成。研究结果发现，3FTxs CTx3 和 CTx4 与肝素具有高亲和力，而PLA2的结合亲和力较弱。进一步的实验表明，肝素能够有效抑制3FTxs CTx3 和 CTx4 的细胞毒性，但对其他毒素如CTx1的影响不大。肝素和N-乙酰肝素可以阻断多种眼镜蛇毒液的细胞毒性，但对其他毒蛇如锯鳞蝰蛇和泡芙加法器的毒液无效。这表明肝素和其低分子量衍生物可能作为眼镜蛇毒液的潜在解毒剂。

五、类肝素可防止眼镜蛇毒液引起的皮肤损伤

研究人员发现肝素和类肝素药物可以保护人表皮角质形成细胞免受眼镜蛇毒液诱导的细胞毒性。蛇毒液能引发细胞死亡，而肝素能提高细胞存活率。在体内测试中，类肝素药物显著减少了眼镜蛇毒液导致的皮肤坏死，其中丁扎肝素效果最佳，病变面积平均减少了94%。进一步研究显示，不同剂量的丁扎肝素均能有效减少皮肤坏死病变的大小，并减轻皮肤层的损伤。研究表明，类肝素药物通过阻断毒液中的某些成分，可以预防眼镜蛇毒液引起的严重局部皮肤坏死。

图5 蛇毒诱导的皮肤坏死在体内被肝素类药物抑制

综上所述，研究人员利用CRISPR文库筛选技术确定了对蛇毒细胞毒性至关重要的多个基因和途径，包括肝素/硫酸肝素的生物合成。这项研究使人们发现类肝素可以预防眼镜蛇毒液相关的皮肤坏死，为吐出眼镜蛇毒液的提供一种潜在疗法。