3D生物打印咋实现？重组弹性蛋白来助力！

Human-Recombinant-Elastin-Based Bioinks for 3D Bioprinting of Vascularized Soft Tissues是发表于《ADVANCED MATERIALS》上的一篇文章，介绍了一种基于重组人原弹性蛋白的生物墨水，用于3D生物打印复杂软组织。该生物墨水由GelMA和MeTro组成，具有高生物相容性。通过测试，其机械性能良好，可打印性强，细胞相容性高。用该生物墨水打印的血管化心脏组织模型，在体外呈现出内皮屏障功能和心脏细胞自发跳动，体内降解和生物相容性良好。该研究展示了MeTro/GelMA生物墨水在打印3D功能性心脏组织方面的潜力，但3D打印工程器官仍面临挑战。

*本文只作阅读笔记分享*

一、引言

组织工程在解决器官移植短缺、药物筛选以及研究生物功能等方面具有巨大潜力，但传统平面制造技术难以创建复杂的多尺度架构，如血管内皮与周围结缔组织和实质细胞之间的界面，这限制了其对相应组织基本功能的研究。

例如，在一项研究中，Dvir和同事3D生物打印了一个脱细胞ECM水凝胶成血管化心脏模型，但该构建体未在体外长期灌注，且封装细胞的活力和功能未被报道。

二、基于重组人原弹性蛋白的生物墨水

（一）材料选择

我们提出了一种高度生物相容的重组人原弹性蛋白基生物墨水，用于3D生物打印复杂的软组织。该生物墨水由两种ECM基生物聚合物 gelatin methacryloyl（GelMA）和 methacryloyl - substituted recombinant human tropoelastin（MeTro）组成，可通过可见光交联。

弹性纤维对脊椎动物组织至关重要，如血管、皮肤、肺和心脏，原弹性蛋白的弹性源于其分子间排列，由交替的疏水和亲水结构域（包括赖氨酸残基）控制。此外，原弹性蛋白提供细胞结合基序和细胞信号通路，支持内皮细胞募集和生长，在迁移和血管生成中起重要作用。

明胶作为生物墨水的基础材料，具有许多类似于胶原蛋白的特性，如细胞结合位点和MMP降解位点。体内弹性蛋白通过原弹性蛋白的赖氨酸残基酶交联合成，而重组人原弹性蛋白可化学修饰为MeTro，可光聚合形成高弹性水凝胶，明胶骨架也可化学功能化为GelMA。

（二）机械性能测试

通过拉伸和压缩测试，发现MeTro/GelMA水凝胶的拉伸模量高于纯MeTro水凝胶，低于纯GelMA水凝胶；延展性和极限应力值呈现相反趋势；压缩模量介于纯GelMA和纯MeTro水凝胶之间。能量损失计算表明，MeTro的加入增加了复合水凝胶的弹性。

三、生物墨水的性能测试

（一）流变性能与可打印性

原本MeTro/GelMA溶液的粘度约为162.6 mPa·s，添加明胶后，粘度超过3000 mPa·s，提高了20倍，呈现出非牛顿行为和高储能模量。

通过FRESH打印技术和优化打印参数（15kPa压力和30mm/s速度，8 - 10°C温度），实现了复杂结构的打印，生物墨水流出喷嘴顺畅，可打印多层结构（如16层晶格结构）且具有可靠的打印保真度。

（二）细胞相容性

使用不同细胞类型进行测试，如3T3细胞、心肌细胞（CMs）、心脏成纤维细胞（CFs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。在2D和3D培养条件下，细胞活力均较高（> 90％），且不影响细胞表型，如CMs表达肌节α - 肌动蛋白，HUVECs表达CD31。

四、血管化心脏组织的3D生物打印

（一）模型构建

制备两种生物墨水：加载CFs/CMs和HUVECs的GelMA生物墨水代表实质心脏组织；加载HUVECs的MeTro/GelMA生物墨水用于血管形成。

构建的心脏组织模型由67层组成，长、宽为7.2mm，高为16.5mm，生物打印过程约11分钟，光交联3分钟。

（二）体外分析

细胞活力：培养15天内，CFs/CMs和HUVECs的活力高于85％。

细胞表型：通过免疫荧光染色证实细胞表型保持良好，内皮细胞在整个构建体中增殖，CMs相互连接。

内皮屏障功能：HUVECs负载结构的扩散渗透性降低约2倍，证实了内皮的屏障功能。

心脏兴奋 - 收缩耦合（EC耦合）：从第5天开始观察到CMs收缩，15天内收缩变得更加同步，跳动频率和协调度达到42.0 ± 3.1 bpm和73.1 ± 3.2％。

五、体内降解和生物相容性评估

将3D打印的MeTro/GelMA和GelMA生物墨水的无细胞构建体皮下植入大鼠，结果表明：

植入后21天平均生物降解率为67.4 ± 11.9％，组织学染色显示有效生物降解和与周围组织的显著整合。

第7天观察到纤维囊，但14和21天后消失，表明炎症反应极小。

免疫组织化学染色显示第7天有CD3和CD68抗原浸润，但21天后反应消失，证明打印构建体的生物相容性高。

六、结论

我们首次使用重组人原弹性蛋白结合明胶作为弹性生物墨水进行3D生物打印，构建的血管化心脏组织在体外和体内表现出良好的性能，证明了MeTro/GelMA生物墨水在打印复杂的3D功能性心脏组织方面的潜力，但3D打印在工程整个器官方面仍面临挑战。

参考文献

Lee S, et al. Human-Recombinant-Elastin-Based Bioinks for 3D Bioprinting of Vascularized Soft Tissues. Adv Mater. 2020 Nov;32(45): e2003915.