动物行为与光电专题（40）丨双光子在体钙成像在小鼠帕金森病模型应用

选取适龄的小鼠使用三溴乙醇腹腔注射进行麻醉，之后使用剃毛器剃除头部毛发，使用立体定位仪定位目标皮层。然后使用高速颅骨钻，钻出一个大约0.2mm2的小洞，随后使用微量注射控制台和微量注射泵将相关腺相关病毒注射到目标皮层的第五层，速度设置为40nL/min，注射完成后留针10-15min，以防止病毒泄露至其他区域。病毒注射完成后，涂抹碘伏杀菌，然后将头皮缝合，放回到鼠笼，等待病毒表达及相关处理。

双光子在体钙成像实验

由于需要做小鼠活体清醒时钙成像实验，所以该实验分为两步进行。在第一天准备阶段，首先选取实验小鼠腹腔注射三溴乙醇进行麻醉，使用剃毛器剃除头部毛发，之后使用手术剪去除头皮组织，并使用酒精棉球擦拭除去颅骨表面结缔组织，向小鼠眼睛涂抹卡波姆滴眼液。随后将两根固定棒以恰当的距离平行粘在小鼠颅骨上，进一步使用牙科水泥进行加固。等待固定完成后，将小鼠放回鼠笼饲养。第二天进行实验阶段，在正式实验之前将小鼠提前固定适应0.5-1h，然后使用高速颅骨钻在目标脑区制作一个圆形成像区域，小心去除颅骨，避免出血，保留硬脑膜，随后盖上盖玻片并使用胶水封闭缝隙。等待胶水凝固后，用ACSF小心清洗盖玻片表层，去除污渍后滴加超纯水后，就可以进行双光子成像。成像时在Time series模式下以2Hz的速度进行图像采集。所采集得到的图像使用ImageJ软件进行分析。

转棒实验

加速转棒实验被用来检测小鼠的运动学习能力。该实验使用Rotamex Rotarod系统，参数设置为：最小速度2rmp，最大速度为80rmp，加速度为5，单方向转动。共分为三天进行，在每天中午进行三次测量，每次开始之前使用酒精擦拭除去味道，并将小鼠放于2rmp转棒上适应1min，然后开始计时直到小鼠掉落或者小鼠抱杠旋转3圈为止，最后统计每只小鼠三次时间取平均值代表该小鼠当天运动能力。

旷场实验

旷场实验被用于检测小鼠焦虑情绪及自主运动能力。该实验使用50cm×50cm×50cm的透明旷场，旷场中心区域为（25cm×25cm），使用动物行为分析软件来跟踪记录和分析小鼠在旷场中10min的运动轨迹及时间。使用中心区域停留时间来衡量小鼠的焦虑水平，在旷场内总移动距离衡量小鼠自主运动能力。

爬杆实验

爬杆实验是用来检测小鼠的肢体协调能力的实验之一。该实验是将一直径为2.5cm的乒乓小球固定于一根长为70cm、直径为1cm的竹竿顶端，并在竹竿上缠纱布防止打滑。将小鼠置于球顶，使其沿着垂直竹竿从上向下爬动，记录所使用时间，共进行三次，每次间隔5min。在正式开始之前一天，让小鼠学习2-3次。

平衡木实验（横杆跑动实验）

平衡木实验（横杆跑动实验）被用来检测小鼠平衡能力和运动能力。该实验在一昏暗安静房间进行，使用一宽3cm，长70cm的扁平木板，并在平衡木一端连接一干净小鼠的鼠笼，整个装置距离地面高100cm。将小鼠放到平衡木另一端，记录小鼠从平衡木一端穿越到鼠笼所用的时间，共进行三次，每次间隔5min。在正式实验开始之前，训练小鼠3-5次。

埋珠实验

埋珠实验被用于检测小鼠的焦虑水平及刻板行为。该实验在一安静环境下进行，将小鼠单独放入一个实验箱，铺满高5cm的垫料，并放入15颗大理石珠，共放3排，每排5颗，测试10min，然后人工统计掩埋体积>50%的大理石珠数量，共进行三次。

巴恩斯迷宫实验

巴恩斯迷宫被用于评估小鼠的空间学习和记忆能力。该实验在安静黑暗环境下进行，使用一个直径为60cm，厚度为15mm的圆形乳白色亚克力板制作而成，在其边缘1cm处均匀分布有12个直径为5cm的圆洞，同时配备有两个五面的开放性黑色盒子，规格分别为20cm×8cm×8cm及10cm×10cm×10cm，一个为起始盒，一个为躲避盒，整个装置被放置于距离地面100cm高的可旋转的支柱上。使用动物行为分析软件来跟踪记录和分析小鼠的运动轨迹及时间。

具体实验步骤如下：

第一天正式实验开始前两个小时提前将小鼠安置于黑暗安静环境中，并依次单独置于躲避盒内适应2min。

将实验小鼠从黑暗环境取出，放置于位于迷宫中央的黑色起始盒内。

移开起始盒，开始追踪小鼠轨迹。当小鼠身体完全进入躲避盒，则计为成功逃避，并让小鼠在躲避盒内停留30s，每次最多观察4min。若在此期间，小鼠未能够成功找到躲避盒，则将小鼠人为放入躲避盒内并停留30s。每只动物开始前都要使用酒精对迷宫进行除味。

之后第2-5天实验步骤均同上，除去单独放入躲避盒内适应，且要保证都在同一时间段内进行，并且每天训练时最好将迷宫随机转动数个洞的位置，但要确保躲避盒始终固定在同一方位，以防止小鼠依靠气味而非记忆来确定躲避盒的位置。

实验参数：找到安全盒的潜伏期（时间）和在此之前的错误次数（小鼠把头伸向或嗅探任何一个非目标洞记为一次）。

新物体识别实验

新物体识别实验是利用小鼠对于新奇物体的探索行为而设计的检测学习记忆的方法。实验分为两天进行，第一天是学习阶段和短期记忆阶段，第二天是长期记忆阶段。在实验开始的前一天，将小鼠置于实验箱（50cm×50cm×50cm）中饲养以提前适应实验盒子。在第一天学习阶段，在实验箱的左上角和右上角放置完全相同的两个柱形隔离笼，快速将小鼠面向两隔离笼，放置于底部中间位置，然后启动追踪记录软件，使小鼠在箱内自由探索10min。之后将小鼠取出，单独置于一鼠笼，等待30min以进行短期记忆测试。在短期记忆阶段，在将试验箱右上角的物体换为以新奇物体，然后按照学习阶段方法将小鼠放入箱内使其自由探索5min。间隔24h后，进行第二天的长期记忆阶段，与第一天短期记忆阶段实验相同。实验使用动物行为分析软件记录并分析小鼠各个阶段的探索过程及对不同物体的探索时间。注意：实验要保证在安静环境下进行，并且每一只小鼠进行实验前都要使用酒精对试验箱及物体进除味。

高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验是用于检测小鼠焦虑样情绪的实验。该实验使用十字形迷宫，包含两个开放臂，两个闭合臂，相间排列，开放臂为44cm×12cm，闭合臂膀为44cm×12cm×30cm，整个装置离地高100cm。测试之前，使用酒精擦拭除去残留气味。测试时，将小鼠放入到中心区域，使头朝向开放臂，并用动物行为分析软件记录和分析小鼠在10min的运动轨迹及时间。使用开放臂的停留时间与总时间的比值来衡量小鼠的焦虑水平。

病毒介导的突触核蛋白过表达诱导运动缺陷，但对运动、焦虑或空间记忆的影响很小

在MPTP诱导的早期PD模型中，运动皮层的树突有着显著升高的转化率，并且其钙活动也增加了三倍以上。在注射AAV-SNCA和AAV-mCherry的同时，等比例混入了钙指示剂AAV-CaMKIIα-GCaMP6s到运动皮层的第五层，等病毒表达21天后进行钙成像。

聚核蛋白过表达导致皮质过度活跃

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