聚乙二醇-降冰片烯！有啥用？打印各种结构以支持细胞培养

大家好，今天我们来了解一项关于3D生物打印的研究——《Poly(ethylene glycol)-Norbornene as a Photo-Click Bioink for Digital Light Processing 3D Bioprinting》发表于《ACS Applied Materials & Interfaces》。3D生物打印在组织工程和再生医学领域具有重要意义。目前常用的生物打印技术各有优劣，而数字光处理（DLP）生物打印因其高打印保真度和分辨率等优点备受关注。本研究探讨了8臂聚乙二醇-降冰片烯（PEG8NB）作为DLP生物打印的生物墨水，展示了其在多种细胞培养模型中的应用潜力，为该领域提供了新的选择和可能性。

一、引言

3D生物打印在组织工程和再生医学中具有重要意义。常见的3D生物打印技术包括挤压式、喷嘴式和光聚合式（如立体光刻SLA、数字光处理DLP 等）。挤压和喷嘴式生物打印中，常用的生物墨水如聚乙二醇（PEG）衍生物在高浓度时粘度低，可能需要添加改性剂或使用特定浴来支持打印，且打印过程可能对细胞造成损伤。而光聚合式生物打印中的数字光处理技术具有打印速度快和打印保真度，所用生物墨水不需要高粘度。

二、优化可见光引发的硫醇-降冰片烯光交联用于数字光处理打印

光强度测量：测量安装在LUMEN X+DLP打印机上的可见光源（405 nm）在不同功率输出（25% - 40%）下的光强度，分别为10.3、13.4、16.2和19.2 mW/cm2，该范围常用于原位细胞封装。

交联动力学评估：以5 wt% PEG8NB（20 kDa）、4 wt% PEGSH（10 kDa）、10 mM光引发剂LAP和0 mM酒石黄的配方为例，G'/G"交叉（凝胶点）在不到1秒内发生，3秒后完全凝胶化。添加酒石黄会延迟凝胶点，如1.5 mM酒石黄使凝胶点延迟至6秒，但不改变平台模量（G' ~ 20 kPa）。在恒定酒石黄浓度（1.5 mM）下，增加LAP浓度会导致更快的G'/G" 交叉，LAP浓度从2 mM增加到15 mM时，凝胶点从12秒减少到3秒。改变PEG8NB 浓度和硫 /NB 摩尔比也会影响凝胶点和平台模量，如 PEG8NB 浓度从 3 wt% 增加到 9 wt%时，凝胶点在3到6秒之间略有变化，但平台模量从～7 kPa 显著增加到～43 kPa；[SH]/[NB] 从1降低到0.2时，凝胶点从3秒延迟到15秒，平台模量从～22 kPa 降低到～0.2 kPa。  

光引发剂选择：硫醇-NB光聚合可由1型光引发剂如LAP（在280 nm至405 nm波长光下裂解产生自由基）或2型光引发剂如eosin-Y（在可见光波长400-700 nm下引发反应）引发。  

对于UV光（如365 nm）诱导的硫醇- NB反应，LAP浓度小于2 mM通常足以引发水凝胶交联，G'/G" 交叉通常在10秒内发生。而在可见光（405 nm）下，由于LAP在405 nm处的吸光度峰值较低（在370 nm处峰值，405 nm处仅保留14.1%的吸收能力），增加 LAP浓度至10 mM可显著加速凝胶化动力学。  

三、使用DLP打印机打印PEGNB的可打印性

打印测试：设计三角形、正方形、六边形和圆形等简单几何形状测试DLP打印保真度。以5 wt% PEG8NB、4 wt% PEG4SH（R = 0.8）、10 mM LAP和1.5 mM酒石黄组成的树脂为例，打印过程中，前2层曝光30秒以提高与构建平台的粘附力，随后48层每层曝光10 秒，共50层（总打印时间540秒）。  

所有DLP打印的PEG8NB水凝胶都表现出出色的结构稳定性和高保真度，刚度随 PEG8NB浓度增加而从2.7 kPa增加到 20 kPa（3 wt%到9 wt%），且打印的构建体在PBS中7天内没有发生明显的降解/膨胀。使用商业DLP打印机（最小像素分辨率为50μm），能够打印高达5 mm高度的复杂支架且具有高保真度，无需任何支撑，在9分钟内即可完成打印。

四、DLP 打印的细胞培养模型  

表面修饰与细胞附着：打印基于PEG8NB的孔板装置用于2D细胞培养，通过二次表面固定5mM CRGDS肽和2mM光引发剂 LAP（在365 nm光下曝光1分钟），使表面支持细胞附着。NIH 3T3成纤维细胞在CRGDS固定的孔表面广泛附着，而在没有CRGDS共轭的孔中没有观察到纺锤形细胞。通过图像分析，证实了附着细胞数量更多且圆形度更低，表明 CRGDS固定的DLP打印PEG8NB孔支持细胞附着。

细胞封装与存活：尝试在DLP打印过程中封装细胞，发现细胞在打印的水凝胶中初始存活率较高（超过70%），但长期培养（> 7天）时细胞存活率下降。这可能与DLP打印水凝胶的相对高交联密度和刚度有关。

五、可灌注通道打印  

打印参数调整：使用 DLP 打印制造 PEG8NB 水凝胶隧道结构用于微血管形成。以1 mm直径的蛇形隧道为例，在不同光强度和曝光时间下进行打印测试。结果表明，在较低光强度设置（25%，10.3 mW/cm2）下，无论固化时间（5-20秒/层）如何，都无法获得可灌注通道（尽管该光强度足以打印固体结构）。将光强度设置提高到 30% 且固化时间低于10秒/层时，可获得可灌注通道且直径设计为1 mm；在 30%光强度下，将固化时间延长到15秒/层会导致通道可灌注但直径缩小至约0.8 mm；进一步将固化时间延长到20秒/层会导致不可灌注通道，这是由于PEG8NB水凝胶过度固化。在35%至40%的光强度下，只有当每层固化时间分别保持在10秒和5秒以下时，才能获得设计通道直径的可灌注通道。此外，在较低光吸收剂浓度（如1 mM）下，也会由于硫醇-NB光交联效率高而导致打印结构过度固化。

二次修饰与功能验证：硫醇-降冰片烯光聚合的 PEG8NB 水凝胶允许打印后二次修饰，通过向通道中注入 1 mM LAP和硫醇化罗丹明（Rho-SH）溶液，并在365 nm光下曝光1分钟，荧光显微镜证实了二次Rho-SH固定。此外，DLP打印独立的多通道结构也取得成功，如注入两种颜色染料溶液（绿色和红色）到两个通道中，显示出良好的分离效果。  

体外血管模型构建：选择600μm的通道直径来构建体外血管模型。打印阵列直通道并在支撑层上，打印后去除支撑层，在通道表面共轭细胞粘附CRGDS肽，然后接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）并培养4天。结果发现，HUVECs在2天内粘附在整个微通道表面并形成单层细胞，且血管内皮-钙粘蛋白（VE - cadherin）在第4天更集中地分布在通道表面。

微孔设计与打印：设计并打印 PEG8NB 微孔用于制备均匀的细胞球体。使用DLP打印制造适合24孔板的微孔，选择锥形设计以促进细胞聚集成球体。设计了三种直径（400、800和1000μm）的微孔，并将RFP转导的胰腺癌细胞COLO-357接种到DLP打印的微孔中。  

细胞球体形成与观察：细胞接种后很快形成细胞簇，在24-48小时内形成均匀的球体并在 7 天内保持相对稳定。球体大小与微孔直径相关，但始终小于微孔直径。通过活/死染色显示，球体中心有一些死细胞，而球体周边区域的细胞大多存活，表明DLP打印的微孔具有细胞相容性。此外，还设计了不同几何形状（如三角形、正方形和星形）的微孔来生成不同形状的球体。

本研究建立了PEG8NB作为新的DLP打印树脂，其溶液通过高效的正交硫醇-降冰片烯光点击反应被打印成具有高打印保真度的水凝胶，且适用于打印后水凝胶表面的修饰。DLP打印的PEG8NB水凝胶在低光引发剂和光吸收剂浓度下表现出出色的可打印性，并适用于各种体外细胞培养模型，包括内皮化通道和多细胞球体的形成，展示了其在DLP生物打印应用中的潜力。  

Kim MH, Lin CC. Poly(ethylene glycol)-Norbornene as a Photoclick Bioink for Digital Light Processing 3D Bioprinting. ACS Appl Mater Interfaces. 2023 Jan 18;15(2):2737-2746.