Hans吹响Invasin作为Matrigel替代物的号角

类器官从诞生的那一天起，就和matrigel/bme 等结下了不解之缘。Matrigel虽然应用广泛，但是matrigel是一种mouse Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肉瘤提取物，不但成分复杂而且批间差异大，因此一直有人在研究更加稳定可控的matrigel 替代物，探索了很多类型的材料，如：

合成材料：研究者们开发了多种基于天然和合成聚合物的替代物，如胶原蛋白、透明质酸、海藻酸盐、纤维蛋白等，旨在模拟Matrigel的物理和化学特性。

关键特性：理想的替代物应具备可调的生物降解性、良好的生物相容性、易于加工和储存，并能支持细胞的粘附、增殖和分化。

相关文章虽然有很多，我前期的文章也曾经总结过这方面的进展（类器官纸上谈兵系列：3D 类器官与基质胶，自制3D类器官基质胶指南），但是一篇文章不一样，这一篇文章是类器官大神和开创者Hans Clever署名的，因此可靠性更高一些。

文章的一个技术突破是在2D状态下的类器官sheet，同样可以维持干性与分化的平衡，产生常见的上皮细胞类型，而且可以传代。

文章的思路也很有意思，选择这个蛋白的原因是这是一个肠道细菌的一个蛋白，并且在免疫学领域已经有了很多相关研究，但是免疫学的研究集中在这个细菌蛋白如何通过与整合素的结合进入M 细胞。这也算是他山之石可以攻玉的一个典型。

我想最核心的一个思路是，如何找到一个与细胞膜表面整合素高效结合的蛋白，不但能够高效结合，而且还得发挥正常的功能，比如联通或者激活细胞内的信号通路等。

本文探讨了Matrigel替代物的开发及其在肠道干细胞和类器官培养中的应用。Matrigel作为一种广泛使用的细胞培养基质，虽然效果显著，但存在批次间差异、成本高及动物源性导致的伦理和安全问题。因此，寻找Matrigel的有效替代物成为当前研究的热点。

α6β1整合素在结肠类器官生长中的重要性

o研究表明，α6β1整合素在结肠类器官与Matrigel或BME（基底膜提取物）的相互作用中起到关键作用。通过基因敲除技术，发现α6β1整合素缺失的结肠类器官在Matrigel或BME中的生长显著受限。

o使用ATP发光检测法量化细胞存活率，结果显示，野生型结肠类器官在Matrigel和BME中的存活率显著高于α6β1整合素敲除型。

Yersinia invasin蛋白作为Matrigel替代物的潜力

oYersinia pseudotuberculosis和Yersinia enterocolitica的invasin蛋白能够模拟Matrigel的某些功能，通过与细胞表面的β1整合素结合，促进细胞粘附、生长和分化。

o研究发现，Invasin蛋白的特定片段（如Inv497）能够支持结肠和回肠类器官在二维和三维条件下的长期生长。

o序列比对分析显示，Y. pseudotuberculosis和Y. enterocolitica的invasin蛋白在整合素结合域上存在高度保守的关键氨基酸残基，这些残基对于其与整合素的相互作用至关重要。

Invasin蛋白支持肠道类器官的建立与维持

o利用Inv497片段作为基质，成功从人肠道组织建立了稳定的肠道类器官培养体系。这些类器官在形态、结构和功能上均表现出与Matrigel培养的类器官相似的特征。

o通过免疫荧光染色和流式细胞术分析，证实了Inv497基质上培养的肠道类器官具有正常的细胞组成和分化模式，包括上皮细胞、干细胞等。

o长期培养实验表明，Inv497基质支持的肠道类器官能够维持稳定的增殖和分化能力，且在多次传代后仍保持较高的细胞活力和组织完整性。

Invasin蛋白在其他组织类器官培养中的应用

o除了肠道类器官外，研究还探索了Invasin蛋白在气道类器官培养中的应用。结果显示，Inv497同样能够支持气道类器官的稳定生长和分化。

o这表明Invasin蛋白作为一种Matrigel替代物，具有广泛的应用前景，可能适用于多种组织和器官的体外培养。

Matrigel替代物的优势与挑战

o优势：Matrigel替代物如Invasin蛋白具有批次间一致性好、成本低廉、无动物源性污染等优点，有助于提高细胞培养的可靠性和安全性。

o挑战：尽管Invasin蛋白显示出良好的应用前景，但仍需进一步优化其纯度和活性，以确保其在不同实验条件下的稳定性和可重复性。

本文通过深入研究α6β1整合素在结肠类器官生长中的作用，以及Yersinia invasin蛋白作为Matrigel替代物的潜力，为肠道类器官的体外培养提供了一种新的解决方案。未来研究将进一步探索Invasin蛋白在其他组织和器官类器官培养中的应用，以及开发更加高效、经济的Matrigel替代物，以推动再生医学和组织工程领域的发展。

根据文件中提供的信息，Invasin包被的培养板能够支持肠道干细胞以2D形态正常分化出多种上皮细胞类型。文章中提到，通过在Invasin包被的培养板上培养，可以形成具有极性、连接和多种成熟肠道上皮细胞类型的单层细胞，包括：

1. 肠细胞（Enterocytes）：是肠道中最常见的细胞类型，负责吸收营养。

2. 杯状细胞（Goblet cells）：分泌黏液，对肠道起到润滑和保护作用。

3. 潘氏细胞（Paneth cells）：在小肠的底部分泌抗菌肽，对肠道免疫起到重要作用。

4. 内分泌细胞（Enteroendocrine cells）：分泌激素，如肠泌素，参与调节肠道运动和消化。

文章中还提到了使用带有荧光报告基因的细胞系（如FUCCI报告基因）来追踪细胞周期，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）来分析分化后的细胞群。这些实验结果表明，即使在Invasin包被的2D培养条件下，肠道干细胞也能维持其分化潜能，并分化成多种成熟的肠道上皮细胞类型。

此外，通过电子显微镜观察，分化后的细胞显示出成熟的超微结构特征，进一步证实了这些细胞类型的成熟度和功能。因此，Invasin作为一种培养基质，能够模拟体内环境，支持肠道干细胞的长期扩增和分化，为研究肠道生物学和疾病模型提供了一个有力的工具。

Invasin蛋白的制备过程，具体步骤如下：

1. 基因合成与克隆：首先，通过GeneArt (ThermoFisher) 合成了一段优化了大肠杆菌密码子的Yersinia pseudotuberculosis和Yersinia enterocolitica的Invasin蛋白C末端192个氨基酸的编码序列，并克隆到pMalC2x表达载体中。载体中还包括8x-His标签、H3V-3C蛋白酶切割位点、转谷氨酰胺酶FXIII序列和FLAG标签，这些序列被引入到MBP标签的C末端。

2. 蛋白表达：将含有Invasin基因的pMalC2x载体转化到SHuffle T7 K12 Competent E.coli细胞中。在细菌培养至OD600（光学密度）达到0.8时，加入1mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导蛋白表达，持续4小时，培养温度为26°C。

3. 细胞收集与裂解：通过离心收集细菌细胞，然后重悬于裂解缓冲液中，包含50 mM HEPES、200 mM NaCl（pH 7.4）、1mg/ml溶菌酶（lysozyme）、25 U/ml苯唑酸酶（benzonase）、蛋白酶抑制剂混合物，随后进行超声破碎。

4. 蛋白纯化：首先利用Ni-Nta（Qiagen）亲和层析基于蛋白中的8x-His标签进行纯化。然后，通过尺寸排除色谱，使用Superdex S200 increase 10/300 GL色谱柱进一步纯化蛋白，平衡缓冲液为50 mM HEPES（pH 7.4）、200 mM NaCl。

5. 蛋白分析：纯化的蛋白在还原和非还原条件下通过4-15% TGX预制SDS-PAGE凝胶进行分析，使用InstantBlue Coomassie蛋白染料（Abcam）进行染色。通过在线ProtParamTool计算蛋白浓度，结合NanoDrop测定的吸光度。

6. 蛋白切割：纯化的蛋白与HRV-3C（一种蛋白酶）在4°C下过夜反应以切割MBP融合蛋白，从而释放Inv192和Inv497蛋白。MBP_His和HRV3C_His通过Ni-Nta珠子（Qiagen）去除。

由于蛋白切割效率不高，实验中使用了MBP融合蛋白进行上皮细胞培养。这些步骤详细描述了Invasin蛋白的制备过程，以供后续的细胞培养和实验使用。

类器官培养基配方大放送