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陈凯等人利用LNP递送Cas9 RNP,实现肺和肝脏的高效基因编辑

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术具有巨大潜力,如果能够开发出安全且有效的递送方法,CRISPR疗法将为遗传疾病提供广泛的治疗。目前,病毒载体是进行体内CRISPR基因编辑的最常用的递送载体,但病毒载体可能具有免疫原性,还存在病毒基因组整合风险,并且由于持续表达基因编辑器,可能导致脱靶DNA损伤。如果能够克服有效性和毒性方面的问题,那么非病毒载体替代策略可能解决上述局限,为CRISPR基因编辑器的递送提供新选择。

脂质纳米颗粒(LNP)是目前最常用的非病毒递送载体,LNP递送mRNA在肝脏的基因编辑方面已经取得了显著成功。然而,LNP向非肝脏组织递送mRNA仍然存在挑战,LNP递送CRISPR mRNA和sgRNA面临着sgRNA不稳定、mRNA介导的Toll样受体(TLR)激活以及编码基因编辑器的大片段mRNA翻译效率低下等问题,这些问题是mRNA固有的,但可以通过开发新型LNP递送载体来减轻。

核糖核蛋白(RNP)复合物的形式直接递送基因组编辑器,即Cas9蛋白+sgRNA,可能解决基于mRNA和基于病毒递送载体的CRISPR编辑器递送相关的几个局限。特别是,由于RNP的细胞内半衰期较短,预计其引起的TLR活化水平低于mRNA,并产生最小的脱靶DNA损伤。此外,RNP可能提供比mRNA更高的体内编辑效率,因为它避免了大片段mRNA的原位翻译,并通过高亲和力的Cas9结合提供了对sgRNA的天然保护。因此,基于LNP的RNP递送策略具有巨大的转化潜力,然而,RNP缺乏用于有效LNP包裹所需的负电荷密度。而且,制备LNP的条件通常包括可以使蛋白质变性的有机溶剂。此外,虽然LNP递送RNP形式的SpCas9在肝脏中实现了基因编辑,但向肺等非肝脏器官的递送效率仍然不高。

2024年10月16日,加州大学伯克利分校Jennifer Doudna 教授、Niren Murthy 教授团队(陈凯Hesong Han为共同第一作者)合作,在 Nature 子刊Nature Biotechnology 上发表了题为:Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein 的研究论文【1】。

该研究开发了一种用于在体外和体内进行CRISPR基因编辑的通用平台,该平台基于工程改造的热稳定性的iGeoCas9基因编辑酶以及新开发的LNP配方,能够将基因编辑器以RNP形式高效封装、递送和组织特异性基因编辑。LNP递送的iGeoCas9 RNP可能为体内基因编辑疗法的开发提供了新方法。

陈凯

陈凯,本科和硕士毕业于浙江大学化学系,2015年加入加州理工学院 Frances Arnold 教授(2018年诺贝尔化学奖得主)实验室读博,目前在加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna 教授(2020年诺贝尔化学奖得主)实验室进行博士后研究。

研究团队认为,目前限制基于LNP的RNP递送的蛋白质变性问题可以使用耐高温的CRISPR酶替代来解决。与SpCas9或LbCas12a等常用的基因编辑器相比,来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的GeoCas9的Cas9 RNP具有更高的热稳定性和更高的负电荷密度,在LNP介导的递送中具有巨大的潜力。然而,GeoCas9的基因组编辑效率较低,并且需要较大的PAM序列,使其无法编辑大部分基因组位点。

在这项最新研究中,研究团队展示了实验室进化的GeoCas9突变体——iGeoCas9可以在体外以高于野生型GeoCas9的100倍以上的效率编辑哺乳动物细胞,并且在通过LNP进行递送后,可以有效地编辑细胞和动物器官。

基于LNP的平台,其中含有pH敏感的PEG化脂质和阳离子脂质,其递送的iGeoCas9对小鼠神经祖细胞(NPC)、人胚肾293T细胞(HEK293T)和人支气管上皮细胞(HBE)的编辑效率从4%到99%不等(视编辑位点而定)。

这些iGeoCas9 RNP-LNP在与细胞中的单链DNA(ssDNA)模板递送输送时,还能诱导同源重组修复(HDR),并在一次静脉注射后高效地编辑小鼠肝脏和肺部。例如,iGeoCas9 RNP-LNP配方中含有可降解离子化脂质,在Ai9小鼠的整个肝脏组织中平均编辑了37%的组织,在野生型小鼠的整个肝脏组织中也以31%的效率编辑了PCSK9基因,与使用其他递送系统时观察到的编辑水平相当。此外,iGeoCas9 RNP-LNP配方含有可生物降解的可电离脂质,在Ai9小鼠的整个肺组织中平均编辑了16%的细胞,并且在肺部以19%的效率编辑了引起肺纤维化疾病的SFTPC基因,与之前使用的基于病毒或非病毒递送载体的基因组编辑相比,这是一个重大改进,凸显了iGeoCas9 RNP-LNP作为当前基于病毒或非病毒载体的递送策略的替代方案的潜力。

总的来说,这项研究表明,热稳定性的基因编辑器iGeoCas9与优化的LNP结合,可以在体外和体内进行高效基因编辑,是开发CRISPR疗法的一个有前景的平台。

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  • 原文链接https://page.om.qq.com/page/OIoGuidJUuUXu5aHSUtjoiWQ0
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