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用于相位和荧光成像的部分相干照明结构照明显微镜

本研究提出了一种基于部分相干照明(基于PCI)的SIM 设备,用于双模态(相位和荧光)显微成像。部分相干照明(PCI)是通过在单色激光束上放置一个旋转扩散器而产生的,它能抑制双模态图像中的斑点噪声,并赋予仪器良好的切片能力。有了这一系统,就能获得同一样品的无标记定量相位和超分辨/切片荧光图像。该系统已经证明在对透明细胞进行高内源对比度的相位成像和定量成像方面的优越性。同时,课题组还展示了荧光珠、大鼠尾部横切面、小麦花药和木槿花粉的超分辨率和光学切片荧光成像。

2. 方法

基于PCI的SIM设备的原理图如图1所示,其中使用二极管激光器作为照明源。照明光束的强度由中性密度滤光片(NF)调节。照明光束通过扩束器(BE)扩展至直径为 1cm。光束由望远镜系统L1-L2中继到数字微镜设备(DMD)。扩散器放置在望远镜系统(L1和 L2)的焦平面附近,扩散器固定在电机上。

图 1   部分相干照明的结构照明显微镜示意图

3. 实验与结果

3.1. PCI在光束均匀性和散斑降噪方面的特性

进行了第一个实验,以证明通过旋转光学扩散器来降低散斑噪声的能力。在这个实验中,通过将灰度值为1的普通图像加载到DMD上来使用平面波照明。结果表明,使用旋转光学扩散器可以显著提高光束均匀性,PCI比CI具有更低的噪声水平(波动)和更高的空间分辨率。

图 2  相干和部分相干照明下的图像质量比较

3.2 条纹对比度分析

为了定量分析条纹对比度,我们在DMD上加载二元条纹图案来照亮样品,并在不同的照明设置下监测产生的条纹,使用单色激光进行CI,使用旋转光学扩散器或LED进行PCI。结果表明,与使用单色激光的CI相比,基于旋转光学扩散器和LED的PCI显著降低了散斑噪声。通过旋转光学漫射器来降低照明的空间相干性可以大大抑制散斑噪声,也不会损失太多条纹对比度,这将保证超分辨率图像重建的良好质量。

图 3. 照明条纹是通过使用高相干激光(a)、在照明路径中嵌入旋转光扩散器(b)和使用 LED 照明(c)产生的。(d) 分别沿 (a)、(b) 和 (c) 中的线条的强度分布图

3.3 基于PCI的SIM的定量微分相差(qDIC)成像

通过验证性实验验证了所提出的技术对具有高内源性对比度的透明样品进行qDIC成像的能力。实验时使用小鼠脂肪干细胞(ADSC)作为相样品。比较表明,PCI下的条纹比CI下的条纹更均匀,信噪比(SNR)更高。与基于CI的qDIC方法相比,基于PCI的qDIC在重建的幅度和相位图像中具有更低的相干噪声,因此具有更高的信噪比。

图 4 .小鼠脂肪干细胞(ADSC)的qDIC成像。

我们还通过图5进一步证明,在同一样本上可以实现像素间对应的双模态成像(包括 qDIC 和荧光成像)。同时,通过使用特定的荧光标记策略,还能以高对比度进一步观察细胞内的不同细胞器。

图 5. 小鼠脂肪干细胞(ADSC)的qDIC和荧光成像

3.4 基于PCI的SIM的合成孔径非荧光成像

我们进一步证明了基于PCI的SIM在沿透射光束路径对非荧光样品进行成像方面的优势。我们使用二氧化硅珠作为样品。实验结果表面相比传统明视野图像,基于PCI的非荧光SIM图像中的珠子更加清晰,分辨率更高。基于PCI的非荧光SIM能提高低数值孔径物镜的空间分辨率,并观察到样品的适当结构。基于PCI的无荧光SIM具有更好的去模糊能力、分辨率增强能力。

图 6. 基于PCI的二氧化硅珠SIM成像

然后,我们使用传统明场显微镜、基于 CI 的非荧光 SIM和基于 PCI 的非荧光SIM对大鼠尾部横切面进行成像。这三幅图像的对比证实,基于 CI 和 PCI的结构照明都能提高空间分辨率和图像对比度,而基于PCI的非荧光SIM能通过抑制斑点噪声(通过时间平均化)进一步提高图像质量。

图 7. 大鼠尾部横切面在明视野光学显微镜平面波照明下的散射图像(a)、基于 CI 的非荧光 SIM(b)和基于 PCI 的非荧光 SIM(c)。

3.5 基于PCI的SIM的超分辨率荧光成像

我们进一步证明了基于PCI的SIM在反射光束路径中对荧光样品成像的优势。首先,通过对直径为500 nm的荧光珠成像,证明了空间分辨率的提高。然后,我们通过传统的宽视场显微镜和基于PCI的SIM对夹在两个盖玻片之间的小麦花药进行成像,后者显示出更精细的结构和更清晰的背景。结果再次证实,与宽视场显微镜相比,基于PCI的SIM模式可以显示同一样品更精细的结构。

图 8. 500nm直径荧光珠的超分辨率成像。

图 9. 用传统宽场显微镜和基于 PCI 的 SIM 对小麦花药进行成像。

3.6 基于PCI的SIM的光学切片成像

除了超分辨率,光学切片(OS)也是结构照明显微镜的另一项功能。与超分辨SIM不同,OS-SIM只需单向条纹照明,条纹的最佳频率为光学系统截止频率的一半,即可获得最佳切片效果。通过此操作,可以消除失焦模糊。

并行比较了使用传统宽视场显微镜、基于CI的SIM和基于PCI的SIM获得的花粉粒切片图像。比较结果表明,基于PCI的SIM在光学切片方面优于基于CI的SIM,因为随着轴向散焦距离的增加,部分相干条纹照明的对比度衰减得更快。同时,基于PCI的SIM图像具有更高的信噪比(SNR)和更少的来自焦外区域的伪影。

图 10. 花粉粒的光学切片图像

更多详细信息请点击阅读全文查看。

https://opg.optica.org/oe/fulltext.cfm?uri=oe-29-21-33679&id=460087

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