佰莱博干货分享：一文读懂蛋白与DNA相互作用研究方法

前言

在细胞内部，蛋白质与核酸之间的相互作用是推动几乎所有生物过程的关键力量，这些过程涵盖了基因的表达、修复、遗传信息的传递以及调控等多个方面。深入地研究和理解蛋白质与核酸之间的相互作用，对于揭示细胞功能的奥秘、解析疾病发生的机制以及促进药物的开发和创新具有极其重要的意义。基于此，本文将详细介绍几种用于筛选和验证蛋白质与 DNA 之间相互作用的有效方法。

酵母单杂交（yeast one-hybrid）

将报告基因连接在特定顺式作用元件或目的启动子下游，将转录因子构建至可以表达转录激活结构域（AD）的载体上。如果特定顺式作用元件或目的启动子和转录因子结合就会激活下游启动子，从而促使报告基因表达。因此，可以通过检测报告基因表达来判断蛋白和 DNA 是否发生互作。酵母单杂既可以用来筛选与目的启动子相互作用的转录因子，也可以验证二者的相互作用。

DNA pull down

DNA pull down 技术是一种用于探究蛋白质与 DNA 分子间相互作用的实验方法。该技术的核心原理是利用生物素化的 DNA 探针作为“诱饵”，在细胞裂解液中特异性地捕获并富集与之结合的蛋白质。该技术主要用于筛选与核酸存在相互作用的蛋白质。

Chip（染色质免疫共沉淀）

通过甲醛交联固定细胞内蛋白-DNA 复合体，随后通过断裂 DNA 链，利用特异性抗体对目标蛋白及其相互作用的 DNA 片段进行富集。接着进行解交联处理并纯化这些 DNA 片段，最终通过测序技术，可以实现对蛋白-DNA 相互作用的鉴定。

Cut-Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)

Cut-Tag 是一种新型 DNA-蛋白互作研究技术，主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合或分布位点。创新性地使用了 ProteinA/G-Tn5 融合蛋白来结合目的蛋白上的抗体，并特异性切割目的蛋白结合的 DNA，最终结合 NGS 实现靶蛋白结合位点的精准定位。

双荧光素酶实验

将启动子的特定片段插入到含有报告基因的质粒中（插入到报告基因的5’端），将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞，如果此转录因子能够激活靶启动子（转录因子与启动子结合），则报告基因就会表达，报告基因的表达量与转录因子的作用强度成正比。

EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA 分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果该核酸分子可以和目标蛋白质结合，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，因而在凝胶中出现滞后的条带。

SPR（表面等离子共振）

SPR 技术，即表面等离子共振，是一种利用光学原理检测生物分子相互作用的方法。实验中，偏振光照射金属薄膜表面，通过棱镜全反射。当 DNA 与芯片上的蛋白相互作用时，芯片表面的质量发生变化，折射角改变，导致信号变化，从而分析蛋白与 DNA 的相互作用。

MST（微量热泳动）

MST 技术是一种定量分析生物分子间相互作用的前沿技术，通过精确检测荧光变化，结合灵敏的热泳动现象，定量分析分子间相互作用。将靶蛋白（Target）进行荧光标记，再将 DNA 分子梯度稀释，靶蛋白与 DNA 分子共孵育后进行 MST 检测，从而检测靶蛋白与 DNA 之间的亲和力。

BLI（生物层干涉）

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry，BLI）是一种无标记的、实时监测的光学检测技术。当 DNA 分子与固定在生物传感器表面上的蛋白结合时，光学层的厚度增加，反射光的路径长度比之前更长。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位移。根据此原理，就能判断 DNA 和蛋白的相互作用。

ITC（等温滴定量热）

等温滴定量热法（ITC）是一种量化生物分子相互作用的技术，通过测量结合过程中释放或吸收的热量来分析蛋白质间的相互作用。实验中，样品池含有目标蛋白，滴定针内装有相互作用的 DNA 分子。每次滴定产生热量脉冲，根据热量变化来判断蛋白与 DNA 分子的相互作用。

分析性超速离心技术（analytical ultracentrifugation，AUC）

分析型超速离心技术利用沉降速率（sedimentation velocity, SV）和沉降平衡（sedimentation equilibrium, SE）方法，通过紫外/可见光、干涉光以及荧光检测器来记录样品池中生物大分子径向浓度分布，可获取分子的分子量、纯度、聚集状态以及生物分子间相互作用等信息。

荧光偏振技术（Fluorescence Polarization，FP）

荧光偏振技术通过检测荧光偏振光强度的变化来研究分子间的相互作用。荧光偏振光强度与分子的转动速度成反比，当 DNA 与目标蛋白结合后，形成的复合物较大，旋转速度变慢，从而导致荧光偏振度的增加。通过测量偏振度的变化，可以分析 DNA 和蛋白质间相互作用。

除了上述的湿实验方法外，已有许多转录因子和 DNA 结合的数据库可供大家查询检索，比如 hTFtarget、KnockTF、JASPAR、GRNdb、TRRUST、HOCOMOCO、TransmiR、ChEA3、GTRD、footprintDB 等。通过这些数据库，可预测转录因子和基因的结合，是研究转录因子功能的重要工具。

佰莱博生物提供生物物理、生物化学、细胞生物学及计算机模拟等多个层面分子互作筛选及验证服务。同时也提供毫克至克级高纯度高活性重组蛋白定制服务。

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