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科研大会 | Harvey F. Lodish:基于tRNA 的基因疗法

讲者

Harvey F. Lodish

麻省理工学院生物学教授和生物工程学教授

Whitehead Insitute创始成员

美国科学院院士

美国艺术与科学院院士

今天,我是作为生物技术公司Tevard的创始人、董事会成员和咨询委员会主席,来进行这个演讲的。Tevard公司,是基于转运RNA(tRNA)的基因治疗先驱。

我与Warren Lammert(在座)和Daniel Fischer共同创办了这家公司,他们的女儿都患有Dravet综合征。这是一种由电压门控钠通道基因的一个拷贝功能丧失引起的单倍剂量不足遗传性疾病。

我要介绍的成果并不来自我的实验室,而是从众多神经学家、遗传学家和分子生物学家的讨论中得出的,我们在思考如何开发出用于更广泛遗传疾病的治疗方案。一方面,是单倍剂量不足遗传性疾病,由一个基因拷贝的功能丧失引起;另一个方面,和它部分重叠,是由无义突变引起的基因突变。

由于我是作为公司成员站在这里,我向大家展示的是对我们基因治疗进展的宣传。tRNA治疗在初创领域正在迅速崛起。

tRNA:无义突变的“逆转奇迹”

我将首先介绍的是对于15%至50%的所有人类遗传疾病进行的矫正,这些疾病是由一个编码氨基酸的有义密码子变为三种无义密码子(TAA、TAG或TGA)中一种引起的。然后我还将介绍一种增强技术,它可以上调mRNA野生型拷贝,并可用于增加野生型蛋白质的水平,从而治疗各种单倍剂量不足遗传性疾病。

特别提到一点,有一类人类基因突变,尤其是非常大的基因,比如说抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)的基因,目前无法通过任何基因治疗技术进行治疗。我们认为矫正这类基因中的无义突变是非常重要。

回到之前说的Dravet综合征,这是由编码电压门控钠通道基因的一个拷贝上功能丧失突变引起的。有些会在儿童发育早期就发病,但可能并不一定发生在精子或卵子中。这个基因像许多人类基因一样受到严格调控。它在大脑不同区域中的表达水平很不一样,而在抑制性谷氨酸能神经元中非常丰富。现有的治疗方法只能治疗癫痫发作,不能治疗疾病的根本原因。

所以,我将先从逆转无义突变的抑制性tRNA开始介绍。不过首先我要提一下,即使我们能够表达SCN1A ——它是一个非常大的蛋白质,有1200~1400个氨基酸——即使我们能够表达它,过多的蛋白质也是不好的。因此,我们要做的是将蛋白质的水平恢复到正常水平,无论这些细胞中的正常水平是什么。

我们要讨论的是由无义突变导致的15% SCN1A失活突变。我们采用了几种编码精氨酸tRNA的基因,对他们的反密码子进行突变,使其能够识别TGA。这是因为精氨酸被TGA取代是人类基因组中最常见的无义突变。

这是一个模型系统,可用于挽救SCN1A中的其他无义突变。我们还改变了tRNA基因的其他片段,以增加其功能,因为反密码子不仅在密码子识别中起关键作用,还在tRNA功能的其他方面起作用,所以我接下来讲的tRNA包括了反密码子在内的几种突变。

我们通过AAV病毒将这些tRNA递送到细胞。如果没有成功,我就不会站在这里了。左边的细胞培养实验中,我们表达野生型SCN1A蛋白,可以看到这个蛋白。如果一个人的体内表达了突变的精氨酸-UGA,就会产生一种被细胞立即降解的截短蛋白质,图像中就会看不到任何东西。但是,如果同时表达我们的抑制性精氨酸-UGA,无义密码子UGA被识别为精氨酸密码子,从而会产生一个完整长度的蛋白质。大家可以在Western blot上看到结果。

更重要的是,正如预期的那样,这个蛋白质的功能是正常的。右侧显示的整个细胞膜片钳实验显示,当细胞膜上的电压改变时,电压门控钠通道会正常地打开和关闭。

人类基因组中还有其他很多的无义突变。在这里,我们看到丝氨酸、甘氨酸和色氨酸转变为无义突变的例子。通过合作和我们自己的工作,我们获得了可以逆转所有这些无义突变的抑制性tRNA。由于精氨酸-UGA是最常见的基因突变,我们将重点放在这上面。

根本性治愈DMD的方法?

我们经常被问到的一个问题是,这些无义突变的抑制性是否会读取正常的C端链终止密码子。链终止密码子TGATAGTAA位于每个蛋白编码序列的3'末端。具体原因我不深入介绍了,不过我们一直认为抑制性tRNA不会读取3'非翻译区的正常无义突变。这也在右图中的核糖体分布实验中得到了验证。我们观察了细胞中所有mRNA的核糖体分布情况,包括正常细胞和表达各种不同抑制性tRNA的细胞。

大家可以看到,添加抑制性tRNA到这些细胞后,3'非翻译区的核糖体数量没有明显增加。此外,假设核糖体越过3'非翻译区,对某个蛋白质添加额外的氨基酸,我们会看到肽段的形成。而我们试图寻找这些肽段,也没有找到。

这些实验给了我们信心去进入到动物实验的阶段。这是一只Dravet小鼠,带有精氨酸-UGA突变,跟我的联合创始人的两个女儿体内的精氨酸-UGA突变非常相似。如左侧的黑色曲线所示,这些单倍剂量不足的Dravet小鼠在很小就会死亡。我们测试了两种精氨酸-UGA抑制性tRNA的表达使小鼠得以存活,并且看起来可以过正常的生活。

这是因为这些抑制性tRNA抑制并逆转了SCN1A蛋白质的缺陷。在右图中我们可以看到,在表达抑制性tRNA后,这些杂合小鼠中SCN1A蛋白质的数量显著增加。这些实验和其他许多实验表明,将这种方法应用于人类时,效果应该会同样显著。

这张幻灯片显示了1,000个人类基因中无义密码子分布。大家可以看到,无义突变非常多,但只有五六个是最突出。特别是我前面提到的精氨酸到TGA,谷氨酰胺到TAG,然后还有其他几个。因此,通过制作5、6种表达不同的抑制性tRNA的AAV病毒,或者一个可以同时表达2、3种不同抑制性tRNA的AAV病毒,我们可以逆转所有无义突变。不仅仅是在SCN1A中,原则上,就相同的AAV载体,可以逆转几乎任何中枢神经系统基因中的无义突变。

我们与Vertex Pharma的合作就是将这项技术用于杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)。抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)是一个巨大的蛋白质,是人体中最大的蛋白质之一。多种突变致病,而约20%的DMD是无义突变引起的。通过抑制性tRNA逆转这些无义突变,我们可以造出完整长度、正常表达水平的抗肌萎缩蛋白。在座关注DMD基因治疗最新文献的人知道,目前的基因治疗表达4种缩短形式的抗肌萎缩蛋白,或是表达一些剪接修饰物,这样最多也只能部分逆转疾病的毁灭性影响。我们对能够在至少20%的患者中制造出完整长度的抗肌萎缩蛋白是很乐观的,也相信这样可以根本性地治愈这种疾病。

我们仍在不断对抑制性tRNA进行优化改进。这个是可以被氨基酸 tRNA合成所识别的tRNA序列,他们可以被TU延伸因子识别,被核糖体识别。我们的科学顾问委员会成员指出,通过筛选tRNA基因的碱基变化,我们应该可以开发出更好的抑制性tRNA,我们也确实看到了进步。因此,在我们决定将一种或多种抑制性tRNA引入临床之前,还有更多工作要做。

蛋白质产量的倍增秘诀

刚刚讲的这些解决了一类遗传性疾病。第二大类是单倍剂量不足疾病,这些是由于蛋白质的数量仅为正常的一半,导致灾难性的影响。我们的同事Jeff Coller是约翰霍普金斯大学的教授,也是Tevard的联合创始人之一。他开发了一种我们所称的放大技术(Amplifier Technology),从理论和实际中看,这种技术可以上调几乎任何目标mRNA的表达,增加稳定性,从而在mRNA的寿命内制造更多蛋白质。

我想强调一下,人类mRNA,特别是我们关注的mRNA,平均的半衰期相对较短,只有3小时左右。这意味着仅仅延长1~1.5小时的半衰期,就可以大幅上调mRNA在寿命中制造的蛋白质水平,来逆转单倍剂量不足的遗传性疾病。

这是Jeff发表在一本领先生物技术期刊上的论文。Tevard已经获得了这项技术的许可,这使我们可以自由研究和改进以达到治疗疾病的目的。这个技术基于Jeff和其他人的研究,他们发现哺乳动物mRNA的3'序列是一长串polyA,与每25个A的片段的结合是一个polyA结合蛋白。总的来说,3'端的polyA结合蛋白稳定了这些mRNA,通过与其他蛋白质结合,防止核酸酶和其他脱帽酶攻击mRNA。

Jeff所做的是利用了CRISPR蛋白Cas13,它与Cas9类似,使用引导RNA定位。但与Cas9不同,Cas13的靶向对象是RNA而不是DNA。它是一种核酸酶,通常会切割其靶向序列。Jeff对这个核酸酶进行改变,让我们使用Cas13中的引导RNA将一个蛋白质定位到任何所需的目标mRNA上。他制造的蛋白质是一个嵌合蛋白,把无活性核酸酶的Cas13和一段polyA结合,这段polyA可以增强该复合物所定位的mRNA的稳定性。

这个方法在细胞培养中是有效的,不过我们还没有进行动物测试。正如所看到的,这个复合物是dCas13(defective Cas13),即缺乏核酸酶活性的Cas13,它用一个引导RNA来结合目标mRNA。我们将它结合到3'非翻译区;与dCas13基因序列相连的是一段polyA结合蛋白,即PABPC1。

幻灯片左侧可以看到,将dCas13和引导RNA结合在一起,可以上调目标mRNA的水平,例如与Rett综合征有关的Mecp2蛋白质,细胞制造的蛋白质数量有了显著增加。而幻灯片右侧的Jeff的成果还显示,根据定位引导RNA针对3'非翻译区的区域不同,可以在不同程度上上调mRNA的表达,从而使蛋白质的产量达到不同的水平。

这个例子与我们的工作相关性更大,是基于SynGap1蛋白质的,因为SynGap1的单倍剂量不足会导致与Dravet综合征和SCN1A单倍剂量不足非常相似的神经发育障碍,可以看到,我们可以使用这项技术将SynGap1的产量翻倍。

我们还需要进行一系列的实验,希望在小鼠中能看到和细胞培养中类似的效果,然后将这项技术转移到人类身上。但我想让大家记住,人们是可以开发出这些新兴技术,具有治疗遗传性疾病潜力的技术的。

从这张非常简单的幻灯片上可以看到,Tevard正在针对许多遗传性疾病进行研究,其中一些出于保密原因,我不能在这介绍。但可以看到,针对DMD的治疗潜力,即使只治疗10%无义突变DMD患者,也会是一个巨大的进步。

最后,正如我昨天提到的,生物技术是一项团队活动。不是一个人,不是我,带着一个绝妙的想法,然后,嘭,我们就有了治疗方法。这需要多技能的人进行大量的实验室工作和理论分析。要到达Tevard今天所取得的成就,需要儿科和成人神经学家、分子生物学家、细胞生物学家、小鼠遗传学家的科学家,也需要熟悉如何在规模上制造AAV载体等实际应用问题的人。

我想以我开头的幻灯片来结束。我们公司大约有40个人。我们非常乐观,充满希望。真正让我们充满乐观的是公司的技术和员工。我们希望在未来几年内能够回到这个会议,并告诉大家我们已经成功治疗了这些灾难性遗传疾病患者。

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