一、如何筛选与目的蛋白相互作用的靶蛋白(筛选)
蛋白质,作为构成生命活动的基本单元,它们的功能通常不是孤立实现的,而是需要通过与其他生物大分子,例如核酸、膜结构、多糖,或者与其他蛋白质本身,通过复杂的相互作用网络来共同完成。蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)是生物体内许多关键过程的基础,包括信号传导、细胞周期调控、代谢途径的控制等。因此,准确地识别和理解这些相互作用对于揭示蛋白质的功能、阐明生物学机制、阐释疾病发生机理、促进药物靶点的发现以及生物技术的创新应用具有极其重要的意义。下面介绍几种常用的筛选蛋白质相互作用的方法。
01
酵母双杂交(Y2H)
将目的蛋白的 cDNA 文库构建到相应载体上(如转录激活域的载体),与诱饵蛋白的载体共同转入酵母细胞,如果两个蛋白存在相互作用,则能激活下游报告基因表达,使酵母细胞生长,初步判断蛋白之间是否存在相互作用。
02
质谱分析结合亲和纯化(AP-MS,Affinity Purification-Mass Spectrometry)
AP-MS 利用特异性抗体或其他亲和试剂,通过 Co-IP 或 pull down 技术纯化靶标蛋白及其相互作用蛋白,然后用蛋白质组学技术进行鉴定。Co-IP 技术基本实验过程:提取总蛋白,加入偶联特异性抗体的磁珠(或琼脂糖珠)形成抗体-诱饵蛋白-互作蛋白复合物,再通过磁珠(或琼脂糖珠)沉淀诱饵蛋白及其相互作用蛋白。Pull down 技术与 Co-IP 原理相似,通过将固定在磁珠(或琼脂糖珠)标签化诱饵蛋白与样品混合,形成复合物后富集分离并通过蛋白质组学技术鉴定。
03
邻近蛋白标记技术(BioID)
邻近蛋白标记技术通过在诱饵蛋白上融合表达生物素连接酶活性的标签,使邻近的目的蛋白生物素化。使用链霉亲和素磁珠亲和富集生物素化蛋白,纯化并利用质谱技术鉴定这些蛋白,从而确定诱饵蛋白的相互作用蛋白。
04
SPR(表面等离子共振)
SPR 技术是一种利用光学原理检测生物分子相互作用的方法。当目标蛋白与芯片上诱饵蛋白相互作用时,会引起金属表面折射率变化,产生信号变化。收集目标蛋白并进行质谱鉴定,即可得到诱饵蛋白的潜在互作蛋白。
05
BLI(生物膜干涉技术)
生物膜干涉技术(BLI)是一种实时监测分子间相互作用的光学检测方法。它通过检测探头上分子结合导致的光学层厚度变化来记录结合及解离过程。利用此技术,结合质谱鉴定,可以识别与特定蛋白有潜在相互作用的蛋白。
06
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术通过将目的蛋白基因与噬菌体表面蛋白基因融合,并在噬菌体表面表达融合蛋白。通过插入不同外源基因到噬菌体载体,形成展示文库。利用“诱饵”蛋白固定化,筛选出与之相互作用的“猎物”蛋白,并进行质谱鉴定。
07
蛋白质芯片(Protein microarrays)
蛋白质芯片技术通过化学修饰固相载体,固定已知蛋白分子如酶、抗原等。这些生物分子特异性结合待测蛋白,如存在于各种体液中的蛋白。通过洗涤、纯化,利用质谱技术鉴定捕获的蛋白。
08
基于数据库和生物信息学分析
生物信息学预测蛋白质相互作用的方法主要利用蛋白质的序列、结构和功能信息,通过计算方法和数据分析,整合数据库和文献挖掘技术(例如 STRING、BioGRID),以此构建蛋白质相互作用网络,进而预测目标蛋白的潜在互作蛋白。
二、如何验证蛋白与蛋白相互作用(单对单)
在前述筛选潜在蛋白质相互作用的技术中,酵母双杂交、pull-down、表面等离子体共振(SPR)以及生物膜干涉技术(BLI)等亦可应用于蛋白质间相互作用的验证(一对一)。此外,下面将进一步介绍若干用于蛋白质相互作用验证的技术。
01
MST(微量热泳动)
MST 技术是一种定量分析生物分子间相互作用的前沿技术,通过精确检测荧光变化,结合灵敏的热泳动现象,定量分析分子间相互作用。将荧光标记后的靶蛋白(Target)与梯度稀释的另一蛋白孵育,进行 MST 实验检测蛋白间的亲和力。
02
ITC(等温滴定量热)
等温滴定量热法(ITC)是一种量化生物分子相互作用的技术,通过测量蛋白质结合过程中释放或吸收的热量来分析蛋白质间的相互作用。
03
分析性超速离心技术(analytical ultracentrifugation,AUC)
分析型超速离心技术利用沉降速率(sedimentation velocity, SV)和沉降平衡(sedimentation equilibrium, SE)方法,通过紫外/可见光、干涉光以及荧光检测器来记录样品池中生物大分子径向浓度分布,可获取分子的分子量、纯度、聚集状态以及生物分子间相互作用等信息。
04
NanoBit及LCA(splitLuc)技术(荧光素酶互补实验)
NanoBit 和 LCA 是将荧光素酶分成两个片段。将两个片段分别融合到待研究的两个蛋白上,若蛋白间有相互作用,它们结合后荧光素酶恢复活性催化底物发光。LCA 用于植物细胞,NanoBit 用于动物细胞。
05
BiFC(双分子荧光互补技术)
BiFC 技术具体的原理是将荧光蛋白在特定的位点切开,形成不发荧光的 N 端肽段和 C 端肽段,将两个肽段与待研究的蛋白相融合,当目标蛋白相互作用时,荧光蛋白片段会恢复原有构象重新发光。
06
免疫荧光(荧光共定位)
荧光共定位技术通过融合目标蛋白与荧光蛋白,利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号重叠,评估蛋白相互作用。免疫荧光技术使用荧光标记抗体或抗原检测特定蛋白在样本中的分布和定位,通过荧光信号确定目标分子的空间位置和表达丰度,推断蛋白相互作用。
07
FRET(荧光共振能量转移)
FRET 的核心机制是供体荧光分子(donor)在受到激发后,通过非辐射能量转移的方式将能量传递给邻近的受体荧光分子(acceptor),受体分子随后发射荧光信号。当两个蛋白相互作用时,其中一个蛋白的荧光分子发出的光能激发另一个蛋白上的荧光分子发光,从而判断蛋白之间的相互作用。
08
BRET(生物发光共振能量转移)
BRET 技术中,蛋白A与荧光素酶蛋白融合,作为供体;蛋白B融合荧光蛋白标签,作为受体。当A和B相互作用,加入底物后,供体发光激发受体荧光,通过检测信号比值来确定蛋白间相互作用。与 FRET 的区别是 BRET 不使用外源激发光。
09
荧光偏振技术(Fluorescence Polarization,FP)
荧光偏振技术通过检测荧光偏振光强度的变化来研究分子间的相互作用。荧光偏振光强度与分子的转动速度成反比,当小分子蛋白质与目标蛋白结合后,形成的复合物较大,旋转速度变慢,从而导致荧光偏振度的增加。通过测量偏振度的变化,可以分析蛋白质间相互作用。
10
邻近连接技术(Proximity Ligation Assay,PLA)
邻近连接技术依赖于两种针对目标分子的一抗,分别结合二抗-核酸探针(称为 PLA 探针)。当两个蛋白(或分子修饰位点)彼此接近时,探针上的核酸序列会通过 DNA 连接酶作用结合,形成环状 DNA。随后,通过滚环式扩增和荧光标记的检测探针,产生强烈的荧光信号,从而判断相互作用。
11
DEER(Double Electron-Electron Resonance)
双电子-电子共振光谱(DEER)是一种敏感的脉冲电子顺磁共振技术,能在纳米尺度上精确测量生物分子间距离。实验中,自由基(自旋标记)被附着在生物分子(如蛋白质)特定位置,通过微波脉冲激发和检测信号变化,分析不同延迟时间下的信号,从而推断蛋白间的距离和相互作用。
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