牛免疫球蛋白 G（IgG）ELISA KIT 大揭秘

在科研的微观世界里，想精准测出牛免疫球蛋白 G（IgG）的浓度，牛免疫球蛋白 G（IgG）ELISA KIT 可是个厉害帮手。下面就来揭开它的神秘面纱！

一、基础信息

规格和保质期：这个试剂盒有两种 “容量” 可选，96T 和 48T，保质期是 6 个月，具体时长看试剂盒外面的标签。

用途：它专门用来在体外测量血清、血浆或其他生物液体里牛 IgG 的浓度。不过要记住，这东西只能用于科研，绝对不能拿去做临床诊断。

性能特点：它的灵敏度超高，能察觉到低至 0.1mg/mL 的牛 IgG。而且特异性很棒，只认牛 IgG，和类似的物质基本不会搞错。重复性也超厉害，不管是在一块板子上测（板内），还是在不同板子上测（板间），变异系数都小于 10%，能检测的浓度范围在 0.25mg/mL - 8mg/mL 。

二、检测原理

试剂盒用的是双抗体夹心法，这就像一场精心策划的 “抓捕行动”。一开始，把抗牛 IgG 抗体 “铺” 在酶标板上，就好比在一个 “抓捕场地” 设好陷阱。实验开始后，样品或标准品里的牛 IgG 就像 “猎物”，会自动和这些抗体 “抱在一起”。接着，再加入辣根过氧化物酶标记的抗体，这样就形成了抗体 - 抗原 - 酶标抗体的 “三人组” 复合物。反应完后，把没参与反应的东西都洗掉。然后加入显色底物 (TMB)，在辣根过氧化物酶这个 “神奇魔法师” 的作用下，TMB 会变成蓝色，再加终止液，蓝色就变成黄色啦。神奇的是，颜色越深，说明样品里的牛 IgG 越多。最后，用酶标仪在 450nm 波长下测吸光度（OD 值），通过这个数值就能算出样品里牛 IgG 的浓度。

三、实验必备器材

要用这个试剂盒，还得自己准备些东西：

能在 450nm 波长工作的酶标仪，它就像个 “数据读取器”。

不同大小的高精度加样器和配套枪头，像 0.5 - 10uL、2 - 20uL、20 - 200uL、200 - 1000uL ，它们是加样的 “小能手”。

37℃恒温箱，给实验提供合适的 “温度小窝”。

蒸馏水或去离子水，用处可多啦。

四、检测前要做啥

平衡：提前 1 小时把试剂盒和样本从冰箱拿出来，让它们在室温下 “适应适应”。

准备洗涤液：从冰箱拿出来的浓缩洗涤液要是有结晶，别慌，这是正常的。放在室温下，轻轻晃晃，等结晶化了再配洗涤液。比如，把 20ml 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释成 400ml 能用的洗涤液，没用完的放回 4℃保存。20× 洗涤缓冲液按 1：20 用蒸馏水稀释，也就是 1 份 20× 洗涤缓冲液加 19 份蒸馏水。

五、样品怎么收集

血清：全血样品在室温放 2 小时，或者在 4℃放一晚上，然后用 2000prm 的转速离心 20 分钟，取上面那层清液检测就行，装血的试管得是一次性没有内毒素的。

血浆：最好用 EDTA 钠盐当抗凝剂，样品采好后 30 分钟内，用 2000prm 的转速离心 15 分钟，取上清液检测，千万别用溶血和高血脂的样品。

组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01M，pH = 7.4) 把组织洗干净，去掉残留的血，称好重量后把组织剪碎。按照 1:9 的比例（比如 1g 组织就加 9mL PBS，这个比例可以根据实验情况改，但是要记好），把剪碎的组织和 PBS（最好加点蛋白酶抑制剂）放到玻璃匀浆器里，在冰上使劲磨。要是想让组织细胞碎得更彻底，还可以对匀浆液超声破碎或者反复冻融。最后用 5000prm 的转速离心 5 - 10 分钟，取上清液检测。

细胞提取液：贴壁细胞先用冷的 PBS 轻轻洗，再用胰蛋白酶消化，然后用 2000prm 的转速离心 5 分钟收集细胞；悬浮细胞直接离心收集就行。收集到的细胞用冷的 PBS 洗 3 次，每 1×106 个细胞加 150 - 200μL PBS 重新悬浮起来，通过反复冻融让细胞破碎（要是含量少，PBS 可以少加点）。把提取液用 2000prm 的转速离心 10 分钟，取上清液检测。

细胞培养上清或其他生物体液：用 2000prm 的转速离心 20 分钟，去掉杂质和细胞碎片，取上清液检测。

六、样品注意事项

保存问题：样品要是 1 周内就检测，放在 4℃就行；要是不能马上测，就按每次用的量分开装，冻在 - 20℃以下，千万别反复冻融。还有，溶血的样品不能用来检测，结果不准。

浓度问题：试剂盒能检测的浓度范围和样本实际的浓度范围可能不一样，要是样品里要检测的东西浓度比标准品最高值还高，就得根据实际情况稀释，最好先做个预实验，看看稀释多少倍合适。

其他问题：用化学裂解液做组织匀浆或细胞提取液，可能会因为加了化学物质，让 ELISA 测的值不准。还有，有些重组蛋白可能和试剂盒里的抗体不 “合拍”，就检测不出来。

七、具体操作步骤

确定板条数量：算算这次实验要用多少预包被板条，把要用的拿出来放在 96 孔框架里，剩下的放回铝箔袋封好，存到 4ºC。

平衡：试剂盒和样本在室温 (25 - 28ºC) 下待 1 小时，让它们充分达到室温。

设置孔位：把标准品孔、样本孔和空白孔设置好。

加样：标准品孔每个加不同浓度的标准品 50μL；样本孔加待测样本 50μL（要是需要可以先稀释）；空白孔加样本稀释液 50μL。

温育反应：所有孔里每孔加辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜把反应孔封好，放在 37℃水浴锅或恒温箱里温育 45min。

洗板：把液体倒掉，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），等 20s，再把洗涤液甩出去，在吸水纸上拍干，这样重复洗 5 次，也可以用洗板机洗。

显色：每孔加底物 A、B 各 50μL，在 37℃避光的地方放 15min。

终止和读数：每孔加终止液 50μL，15min 内，用酶标仪在 450nm 波长处测各孔的 OD 值。

八、结果怎么算

数据处理：标准品和样本要是设了复孔，就把它们的平均值算出来。

画标准曲线：把标准品的浓度当成纵坐标，O.D. 值当成横坐标，画出标准曲线（怎么画最好，要看回归方程算出来的 R2 值，R2 越接近 1 越好）。

算浓度：通过样品的吸光度值和标准曲线（可以用直线拟合或者 4 参数拟合），算出样品的浓度（工作人员能提供算浓度的软件）。要是样品之前稀释过，就得把算出来的浓度乘以稀释倍数，这才是样品真正的浓度。