睿信生物人 β 淀粉样蛋白 1-42 酶联免疫吸附测定试剂盒操作流程

在神经科学研究以及阿尔茨海默病等相关疾病的诊断与研究中，人 β 淀粉样蛋白 1 - 42（Aβ1 - 42）的准确检测至关重要。睿信生物的人 β 淀粉样蛋白 1 - 42 酶联免疫吸附测定试剂盒为该检测工作提供了可靠的工具，以下是其严谨且有条理的操作流程。

一、实验前准备

试剂准备：从试剂盒中取出已包被抗 Aβ1 - 42 抗体的酶标板、Aβ1 - 42 标准品、酶标记物、底物溶液（A 液和 B 液）、洗涤液、终止液。使用前，所有试剂需平衡至室温（20 - 25℃），这一步骤对保证实验结果的稳定性至关重要。若洗涤液为浓缩液，应依据试剂盒说明书要求，使用蒸馏水或去离子水进行稀释，并充分混匀，确保洗涤液的均一性。

器材准备：准备好不同量程的移液器及配套吸头，移液器需定期校准，确保其准确性，误差应控制在允许范围内。同时，准备好离心机、37℃恒温培养箱、酶标仪（具备检测 450nm 波长吸光度的功能）。使用离心机前，要调试好转速和离心时间；酶标仪需预热 15 - 30 分钟，使仪器达到稳定的工作状态，以保证检测结果的准确性。

二、标准品稀释

确定稀释方案：参考试剂盒说明书所提供的标准品浓度以及所需绘制的标准曲线浓度范围，明确标准品的稀释倍数和具体稀释步骤。通常试剂盒提供的是高浓度的标准品母液，需将其逐步稀释成一系列不同浓度的标准品溶液。

进行稀释操作：用移液器准确吸取一定体积的标准品母液，加入含有相应体积稀释液的无菌 EP 管中。例如，吸取 10μL 标准品母液至 90μL 稀释液中，轻柔吹打混匀，实现 10 倍稀释。按照相同方法依次进行系列稀释，从而得到不同浓度梯度的标准品溶液，如 1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、0pg/mL（作为空白对照） 。每次稀释后，务必更换新的吸头，防止交叉污染，确保标准品溶液的纯净度。

三、加样

标准品加样：将稀释好的不同浓度的标准品溶液依次加入酶标板的标准品孔中，每孔加入 100μL。加样时，移液器应垂直悬空于孔上方，缓慢匀速地将液体注入孔内，避免产生气泡，因为气泡可能会影响反应的均一性和检测结果的准确性。为提高实验的准确性和重复性，每个浓度的标准品需设置 2 - 3 个复孔。

样本加样：将经过适当处理的待测样本（如脑脊液、血清、血浆、细胞培养上清等）加入酶标板的样本孔中，每孔同样加入 100μL。若样本为脑脊液，采集后应尽快检测，若无法及时检测，需冻存于 - 80℃，避免反复冻融；若为血清或血浆，采集后需在 2 - 8℃条件下 3000 转 / 分钟离心 10 分钟，取上清用于检测。加样过程中要确保样本无气泡，且加样量准确，以保证实验结果的可靠性。

四、温育与洗涤

温育：加样完成后，用封板膜将酶标板密封，小心放入 37℃恒温培养箱中温育 60 分钟。在温育过程中，样本中的 Aβ1 - 42 会与包被在酶标板上的抗体以及酶标记物发生特异性结合，形成稳定的免疫复合物。严格控制温育的时间和温度，是保证反应充分进行的关键因素，任何偏差都可能导致实验结果出现误差。

洗涤：温育结束后，小心揭去封板膜，将酶标板中的液体弃去，并将酶标板倒扣在干净的吸水纸上，轻轻拍干。随后，每孔加入 350μL 洗涤液，静置 1 - 2 分钟后，甩去洗涤液，再次拍干。重复此洗涤步骤 5 次，目的是彻底去除未结合的物质，包括未结合的抗原、抗体以及其他杂质，为后续的显色反应创造纯净的环境，确保显色结果只与特异性结合的 Aβ1 - 42 相关。每次洗涤后，要确保酶标板中的洗涤液被充分去除，避免残留液体影响实验结果。

五、显色与终止反应

显色：洗涤完成后，每孔先加入 50μL 底物 A 液，再加入 50μL 底物 B 液，加入过程中要注意避免产生气泡，加完后轻轻振荡酶标板，使其充分混匀。将酶标板放入 37℃恒温培养箱中避光显色 15 - 20 分钟。在显色过程中，酶标记物会催化底物发生化学反应，使溶液逐渐显色，且颜色的深浅与样本中 Aβ1 - 42 的含量成正比，即样本中 Aβ1 - 42 含量越高，溶液颜色越深。

终止反应：当显色时间达到规定时长后，每孔迅速加入 50μL 终止液，轻轻振荡混匀，此时溶液颜色会发生明显变化，反应随即终止。需注意，加入终止液后应立即进行下一步的吸光度测定，以避免时间过长导致结果出现偏差，因为随着时间推移，溶液颜色可能会发生变化，影响检测结果的准确性。

六、结果测定与分析

酶标仪测定：将酶标仪的检测波长设置为 450nm，若酶标仪具备双波长检测功能，可同时设置参考波长为 630nm，以消除非特异性吸收的干扰。将终止反应后的酶标板平稳放入酶标仪中，依次测定各孔的吸光度值（OD 值）。读取数据时，要确保酶标板放置位置正确，避免因位置偏差导致检测结果不准确。

数据分析：以标准品浓度为横坐标，对应的平均 OD 值（扣除空白对照 OD 值）为纵坐标，使用专业的数据分析软件（如 Origin、GraphPad Prism 等）绘制标准曲线。一般采用四参数拟合曲线方程，以确保曲线的准确性和可靠性。根据样本的平均 OD 值（扣除空白对照 OD 值），在标准曲线上查找对应的浓度值，即为样本中 Aβ1 - 42 的含量。若样本在检测前经过稀释，需根据稀释倍数对所得浓度进行校正，从而得到原始样本中 Aβ1 - 42 的实际浓度。

严格按照上述操作流程使用睿信生物的人 β 淀粉样蛋白 1 - 42 酶联免疫吸附测定试剂盒，能够确保实验结果的准确性和可靠性，为神经科学研究以及相关疾病的诊断与治疗提供有力的数据支持。