过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒实验解决方案

原理

过氧化氢（H2O2）是生物体内最常见的活性氧分子，是一种活性氧代谢的副产物，主要由SOD和XOD等催化产生，由 CAT 和 POD 等催化降解。过氧化氢不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面，过氧化氢也是许多氧化应急反应中的关键调节因子。过氧化氢可以激活NF-κB等因子，这些过氧化氢相关的信号途径和哮喘、炎症性关节炎、动脉硬化以及神经退行性疾病等许多疾病相关。过氧化氢也和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。CheKine 过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（微量法），提供了一种简单易用的方法，用于测量血清、血浆、细胞、组织和其它生物液体中H2O2含量。试剂盒利用过氧化氢氧化二价铁离子产生三价铁离子，然后和xylenol orange（二甲酚橙）在特定的溶液中形成紫色的产物，在580 nm的OD值与过氧化氢浓度成正比，从而实现对过氧化氢浓度的测定。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能测580 nm处的吸光度）及水浴锅

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·离心机

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

·10 kDa的超滤管或30% ZnSO4溶液（用来去除蛋白）

试剂准备

Reaction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；建议分装保存在-20℃避光保存。

H2O2 Standard (1M)：即用型；使用前，平衡到室温；整个实验过程中，避光放置；建议分装保存在-20℃避光保存。

Assay Buffer (1×): 使用前，平衡到室温；Assay Buffer (10×)用去离子水1:10稀释后作为工作液。Assay Buffer (1×)可在4℃保存至少2个月，并用来稀释H2O2标准品和样本。

标准品制备：先配制2 mM H2O2 Standard：2 μL 1 M的H2O2 Standard用998 μL的Assay Buffer (1×)稀释；再配制100 μM H2O2 Standard：50 µL 2 mM的H2O2 Standard用950 μL的Assay Buffer (1×)稀释。配制好的标准品需要在4 h之内使用。100 μM H2O2 Standard，按照下表所示，进一步稀释标准品。

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4 h之内使用；如果样本是细胞悬浮液，建议使用培养基配制H2O2标准品。

样本制备

1.动物组织：用冷的PBS清洗组织，尽可能去除血液。吸干组织上的水分，称取0.1 g，加入1 mL预冷的Assay Buffer (1×)，将样本冰上进行匀浆。10,000 g，4℃离心5 min，取上清液做进一步分析。

2.植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL预冷的Assay Buffer (1×)捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），10,000 g，4℃离心5 min，取上清液，置冰上待测。

3.细胞和细菌样本的制备：收集5×106个细胞或细菌，用冷PBS 清洗细胞或细菌后，加入1 mL预冷的Assay Buffer (1×)冰上进行匀浆或冰浴超声波破碎 5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次）。10,000 g，4℃离心5 min，取上清液做进一步分析。

4.血清、血浆、尿液（和其它生物学液体）：去除蛋白后，取上清。去除蛋白的方式：可使用10 kDa的超滤管过滤后取滤液或是将样本：30% ZnSO4溶液=20:1进行混合后涡旋，再10,000 g室温离心5 min，取上清。

注意：建议使用新鲜样本。如果不能马上进行该项实验，建议将样本储存在-80℃保存1个月。当准备好进行该项实验时，将样本从-80℃拿出后，冰上解冻，但是请注意，这可能会影响样本的稳定性，实验结果可能会低于预期；如下物质会干扰检测结果，样本中应避免存在：Ferric salts, iron salts, sucrose, glucose, ascorbic acid, SDS (>0.2%), sodium azide。该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1500的测定。

实验步骤

1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长到580 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2.在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

3.充分混匀，37℃孵育10 min，读取580 nm处的吸光值，记为A空、A标、A测，计算ΔA标=A标-A空、ΔA测=A测-A空。

注意：1. Std.Blank即为空白孔。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。2. 如果ΔA测大于浓度为100 µM标准品的ΔA标，则需要用Assay Buffer (1×)稀释样本后，重新检测。如果样本的ΔA测低于0.005，可提高样本量。

结果计算

1.标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线。

2.样本H2O2浓度计算

将ΔA测代入公式计算出y (1 µM=1 nmol/mL)。

(1)按样本鲜重计算

H2O2含量(nmol/g 鲜重)=y×V样÷(W×V样÷V样总) ×n=y÷W×n

(2)按样本体积计算

H2O2含量(nmol/mL)=y×V样÷V样×n=y×n

(3)按细胞或细菌数量计算

H2O2含量(nmol/104)=y×V样÷(细胞或细菌数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n

V样：加入样本体积，0.025 mL；W：样本质量，g；V样总：加入Assay Buffer (1×)体积，1 mL；n：样本稀释倍数；500：细胞或细菌总数，500万。

结果展示

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线

Figure 1. H2O2标准曲线