一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验解决方案

原理

NO（Nitric Oxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。NO易被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，因此，通常要测定亚硝酸盐和硝酸盐的总量来推算出总的一氧化氮的量。CheKine 一氧化氮（NO）含量检测试剂盒（微量法），采用改进的格里斯法将硝酸盐还原为亚硝酸盐后，即可准确测定NO的生成量。格里斯分析的机理概括为重氮类之间的偶氮耦合，重氮类是由磺胺和 NO2-和 N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐产生的，产生与 NO代谢物成正比的比色（540 nm）产物。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测540 nm处的吸光值）

·恒温培养箱

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·去离子水、PBS (pH 7.4)

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

NaNO2 Standard (1 M): 使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；分装避光保存于-20℃。

Griess Reagent I：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。

Griess ReagentⅡ：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。

VCl3 Reagent：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。

ZnSO4：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；4℃避光保存。

标准曲线设置：取10 µL NaNO2 Standard (1 M)用 990 µL PBS (pH 7.4)稀释至10 mM NaNO2 Standard储备液Ⅰ。取10 µL 10 mM 的NaNO2 Standard储备液Ⅰ用990 µL PBS (pH 7.4)稀释至100 µM NaNO2 Standard储备液Ⅱ。用100 µM Standard储备液Ⅱ按下表所示，进行下一步稀释：

注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

1.动植物组织或细胞样本：称取约0.1 g组织样本或收集500万个细胞，加入1 mL PBS (pH 7.4)，冰浴匀浆，14,000 rpm，4℃离心10 min，取上清液待测。

2.血浆，血清和尿液（和其他生物体液）：直接将样品加入96孔板或微量玻璃比色皿。需要进行去蛋白的样品包括血清、血浆、全血、含有FBS的细胞培养基、组织或细胞裂解物。尿液和唾液不需要脱蛋白。

脱蛋白处理：将150 μL样品与8 μL ZnSO4混合在1.5 mL EP管中，旋涡，然后14,000 rpm，4℃离心10 min。将100 μL的上清液转移到干净的EP管中。

注意：建议您使用新鲜样品，如果不立即实验，样品可在-80℃保存一个月。如果样品需要脱蛋白，则每种标准品应制备150 μL，并同样用硫酸锌处理，避免结果计算中需要使用稀释因子。抗氧化剂和亲核剂（例如β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇和半胱氨酸）可能会干扰检测。在样品制备过程中避免使用这些化合物。

实验步骤

1.酶标仪或可见光分光光度计预热30 min以上，调节波长到540 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2.工作液的配制：每孔需要200 μL工作液，为避免损失，按204 µL每孔体系配制：吸取104 μL VCl3 Reagent，50 μL Griess Reagent Ⅰ和50 μL Griess ReagentⅡ。工作液需现配现用。

3.将100 μL稀释的标准品和样品添加到单独标记的EP管中（建议样品至少重复测量2次）。然后在每个样品和标准管中加入200 μL工作液，混合均匀。

4.将反应体系在37℃下孵育30 min。

5.对反应管进行短暂离心以去除不溶物，并将每个反应体系中分别取250 μL液体转移到96孔板或微量玻璃比色皿中。在540 nm处读取A值，分别标记为ABlank, AStandard和ASample。所有A值减去空白孔A值，计算ΔAStandard=AStandard-ABlank, ΔASample=ASample-ABlank。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A值>1.0，则说明样本NO含量太高，需用PBS（pH 7.4）适当稀释（计算公式中乘以相应稀释倍数）。如果样本的ΔASample低于0.005，可提高样本量。

结果计算

以标准液浓度为x轴，ΔAStandard为y轴，绘制标准曲线。将ΔASample带入方程得到x值（µM）即NO含量。

换算：1 mg/dL NO相当于333 μM，0.001%或10 ppm。

结果展示

典型标准曲线：以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

Figure 1. 96孔板分析的NO标准曲线