丙酮酸激酶(PK)活性检测试剂盒实验解决方案

原理

丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK, EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。CheKine 丙酮酸激酶(PK)活性检测试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动物组织、细胞及细菌样本中PK的活性。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340 nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

自备耗材

·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）

·恒温箱、低温离心机

·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Substrate Mix Working Reagent：临用前配制，48 T的Substrate Mix瓶中加入10.2 mL Assay Buffer和0.6 mL去离子水充分溶解，在96 T的Substrate Mix瓶中加入20.4 mL Assay Buffer和1.2 mL去离子水充分溶解，溶解以后分装，-20℃可保存6个月，避免反复冻融。

LDH Working Reagent：临用前配制，在48 T的LDH中加入0.6 mL去离子水充分混匀，在96 T的LDH中加入1.2 mL去离子水充分混匀，稀释后4℃可保存1个月，冰上放置备用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。

1.动植物组织样本：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

2.细胞、细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），然后8,000 g，4℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。

3.血清等液体的准备：直接测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1251、KTB1341的测定。

实验步骤

1.酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。

2.Substrate Mix Working Reagent置于25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）孵育5 min。

3.96孔UV板或微量石英比色皿中加入10 μL样本，10 μL LDH Working Reagent和180 μL Substrate Mix Working Reagent，迅速混匀。

4.用酶标仪在340 nm下测定20 s时的吸光值A1和2 min 20 s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.005，可延长反应时间到5 min或10 min或者适当加大样本量。如果ΔA大于1.0，样本可用Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A.使用96孔UV板测定的计算公式如下

1.血清（浆）中PK活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PK (U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=3,215×ΔA

2.组织、细菌或细胞中PK活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PK (U/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=3,215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PK (U/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=3,215×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PK (U/104)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=3215×ΔA÷500=6.431×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；109：1 mol=1×109 nmol； V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，5×106。

B.使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。