丙酮酸（PA）含量检测试剂盒实验解决方案

原理

丙酮酸（PA）通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。CheKine 丙酮酸（PA）含量检测试剂盒（微量法）可检测动物组织、植物组织、细胞和细菌、血清（浆）等样品中的丙酮酸含量，其原理是样品中丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红色，该红色化合物在520 nm处有最大吸收峰。在一定的浓度范围内，丙酮酸含量与520 nm吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可计算出样品中丙酮酸含量。

自备耗材

·酶标仪或可见分光光度计（能检测520 nm）

·恒温箱、制冰机、低温离心机

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

·去离子水

·匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Chromogen A：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

注意：Extraction Buffer有毒，Chromogen A有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

Chromogen B：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

标准品制备：

标准曲线设置：按下表所示用Extraction Buffer将1 mg/mL标准溶液稀释至70、35、17.5、8.75、4.375、2.188、1.094 µg/mL的标准液。

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。

1.动物组织：称取约0.1 g组织，加入1 mL Extraction Buffer匀浆，静置30 min，4,000 g，常温离心10 min，取上清液，置冰上待测。

2.植物组织：称取约0.1 g组织，加入1 mL Extraction Buffer匀浆，然后超声波破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），静置30 min，4,000 g，常温离心10 min，取上清液，置冰上待测。

3.细胞/细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加1 mL Extraction Buffer，超声波破碎5 min（功率20%或200W，超声3 s，间隔7 s，重复30次），静置30 min，4,000 g，常温离心10 min，取上清液，置冰上待测。

4.血清（浆）样品：取100 μL血清（浆）加入1 mL Extraction Buffer，充分混匀，静置30 min，4,000 g，常温离心10 min，取上清液，置冰上待测。

实验步骤

1.酶标仪或可见分光光度计预热30 min以上，调节波长至520 nm，可见分光光度计用去离子水调零；

2.样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：

3.混匀，在520 nm波长处测定各孔的吸光值A。计算相对吸光值ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白。（空白孔只需做一管）

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1.标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程计算出y（µg/mL）。

2.样本丙酮酸含量计算

(1) 按样本质量计算：

丙酮酸含量(µg/g)=(y×V样)÷(W×V样÷V提取)×n=y÷W×n

(2) 按血清（浆）等液体体积计算：

丙酮酸含量(µg/mL)=(y×V样)÷(V液×V样÷V提取)×n=10×y×n

(3) 按照细菌或细胞数量计算：

丙酮酸含量(µg/104)=(y×V样)÷(500×V样÷V提取)×n=y÷500×n

V样：加入的样本体积，0.075 mL；V提取：加入Extraction Buffer体积，1 mL；W：样本质量，g；V液：液体样本体积，0.1 mL；500：细菌或细胞数量，500万；n：稀释倍数。

结果展示

典型标准曲线：

Figure 1. 96孔板分析的丙酮酸标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

实验实例：

Figure 2. 试剂盒测定小鼠肝脏、小鼠脾脏、油桃和芦荟中丙酮酸含量。