非洲猪瘟病毒感染后巨噬细胞转录和超微结构的变化

该文章于2024年4月3日在Veterinary Microbiology上发表，IF为2.4。全文链接（DOI）：10.1016/j.vetmic.2024.110074

摘要丨

非洲猪瘟（ASF）是养猪业一种影响极大的传染病，给全球造成巨大的经济损失。病原体非洲猪瘟病毒（ASFV）具有复杂的发病机制，值得进一步探索。在本研究中，我们通过巨噬细胞转录组测序和超微结构透射电镜观察，研究了ASFV感染对宿主基因转录和细胞器变化的影响。转录组测序结果显示，ASFV感染导致猪骨髓源性巨噬细胞（BMDM）基因表达模式发生显着改变，其中2404个基因上调，1579个基因下调。细胞因子和趋化因子在BMDMs表达中发生显着变化；模式识别受体（例如 Toll 样受体和 Nod 样受体）显着激活。根据超微结构观察，ASFV感染细胞中广泛存在线粒体损伤和线粒体自噬。巨噬细胞伪足数量的减少表明病毒引起的结构变化可能会损害巨噬细胞的病原体识别、吞噬作用和信号通讯。此外，巨噬细胞中次级溶酶体的尺寸减小和酸化受到抑制意味着吞噬作用受到抑制。总体而言，ASFV感染导致细胞因子和趋化因子表达的显着变化，并伴随着NLR和TLR信号通路的激活。我们首次报道 ASFV 感染导致伪足数量减少以及次级溶酶体的大小和酸化减少。 

结果丨

1. Construction and quality control of a transcriptional group library

2. Expression pattern of cytokines in ASFVinfected pigs

3.Functional and pathway enrichment analyses of the DEGs 

本研究通过q-PCR和WB验证了ASFV在BMDMs中的成功复制，并通过基因表达分析发现ASFV感染后共有3983个基因显著差异表达，其中上调基因2404个，下调基因1579个。基因集富集分析揭示了59条受ASFV感染调控的信号通路，包括TNF、Jak-STAT、趋化因子、NOD样和Toll样受体信号通路等。GO功能富集分析进一步表明差异表达基因在生物过程、细胞组分和分子功能三个类别中显著富集。热图分析展示了五个信号通路中基因表达的趋势，并通过qRT-PCR验证了测序数据中预测的5个差异表达基因的转录变化，结果与测序数据一致，证实了实验设置和生物信息学分析的可靠性。综上所述，ASFV感染引发了强烈的炎症反应和信号转导。

4.PPI network, module analysis, and hub gene selection 

5.PPI network, module analysis, and hub gene selection

6.PPI network, module analysis, and hub gene selection 

本研究通过透射电镜（TEM）观察发现，ASFV感染导致巨噬细胞（PAMs）发生显著的超微结构变化。正常PAMs中的线粒体膜结构清晰、形态均匀、嵴分布规则，而ASFV感染的PAMs中线粒体出现空泡化、基质中电子致密沉积、嵴扩张和紊乱等损伤特征，并观察到含有细胞质内容物和受损线粒体的自噬结构，提示存在线粒体自噬现象。此外，ASFV感染的PAMs中次级溶酶体边界模糊，内容物含有大量未消化的髓样结构，且溶酶体形态不规则、体积显著减小。伪足数量在感染后也显著减少。为进一步验证ASFV对溶酶体的影响，利用LysoTracker标记溶酶体的位置、大小和酸化水平，并通过激光共聚焦成像分析发现，ASFV感染的PAMs和BMDMs中溶酶体的酸化和体积均显著降低。这些结果表明，ASFV感染导致巨噬细胞线粒体和溶酶体功能受损，并伴随伪足数量减少。 

总结与展望丨

本文讨论了ASFV感染对猪巨噬细胞的影响及其机制。研究表明，ASFV感染后，猪巨噬细胞在感染后18小时内仍保持较大比例的非凋亡状态，且高毒力和低毒力毒株在感染后期诱导的凋亡水平相似。ASFV感染导致宿主基因表达整体上调，尤其是细胞周期相关基因，表明病毒通过激活基因表达触发强烈的宿主抵抗反应。细胞因子在免疫反应中起关键作用，但过度的免疫激活和细胞因子释放可能导致细胞因子风暴，进而引发弥散性血管内凝血、多器官衰竭和死亡。ASFV感染显著增加了单核细胞、T细胞和NK细胞趋化因子的表达，但降低了中性粒细胞和CD8+效应T细胞趋化因子的表达，这可能解释了感染猪体内中性粒细胞增加和淋巴细胞减少的现象。此外，ASFV感染下调了巨噬细胞中TLR的表达，可能削弱了其抗菌功能。线粒体功能障碍和伪足数量减少进一步影响了巨噬细胞的能量代谢、病原体识别和吞噬功能。ASFV感染还抑制了溶酶体的酸化和发育，降低了其降解能力，这可能有利于病毒颗粒的稳定存在。尽管自噬通路未显著富集，但自噬相关基因的下调和次级溶酶体中大量未消化内容物的存在支持了ASFV对巨噬细胞吞噬功能的抑制。这些发现为进一步研究ASFV感染的机制提供了重要线索。