MST应用案例分享：验证蛋白与小分子结合

引文

目前，研究小分子药物与蛋白相互作用的常见的技术包括：CETSA、DARTS、小分子Pull-Down等，这些技术主要局限于定性检测小分子药物与蛋白之间的相互作用，无法定量分析结合的强弱，流程复杂、稳定性差且可能存在假阳性或假阴性的问题。相比之下，微量热泳动技术(MicroScale Thermophoresis, MST)能精确测定药物与蛋白的亲和力，稳定性和重复性好，低浓度下测定分子间的结合不存在假阳性的问题，进一步验证了传统定性方法的实验结果。本文分享了两个采用MST微量热泳动技术测定小分子药物与蛋白互作的案例。

一

案例01.微量热泳动技术(MST)验证小分子药物与靶点蛋白的结合

2024年，同济大学林古法/王志荣/程黎明团队在《Nature Communications》(一区，IF=14.7)期刊上在线发表了题为“Selectively targeting the AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3 axis by SCM-198 as a rapid-acting therapy for advanced acute liver failure”的文章。生物活性小分子SCM-198不仅能够预防(2小时内给药)，还能够治疗TAA、APAP或LPS/D-GaIN诱导的ALF。即使在ALF发病后的24小时给药，也能将ALF小鼠的存活率提高到100%。该研究首次揭示，脂联素受体2(Adiponectin receptor 2, AdipoR2)是SCM-198的选择性靶点，AdipoR2(R335)氨基酸残基是SCM-198-AdipoR2结合和信号传导的关键靶位点，AdipoR2(Y274)氨基酸残基是细胞胞外Ca2+内流的分子开关。SCM-198-AdipoR2的结合诱导细胞外Ca2+内流，进而迅速上调新发现的AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3复合物活性，迅速提高一氧化氮 (Nitric oxide，NO) 产生水平，从而在小鼠急性肝功能衰竭ALF中发挥肝脏保护作用[1]。

本研究中，作者为了验证AdipoR2蛋白是否为小分子SCM-198直接作用靶点，作者通过微量热泳动技术(MST)验证发现：小分子SCM-198与 AdipoR2蛋白存在相互作用，二者结合能力较强，亲和力KD值为2.3078 μM(图1)。

图1 微量热泳动技术(MST)验证AdipoR2蛋白是小分子SCM-198的直接作用靶点

Microscale thermophoresis (MST)

To determine the binding affinity of SCM-198 and ADIPOR2, an MST assay was conducted. Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies) was used. ADIPOR2 was labeled with the Monolith NT Protein Labeling Kit RED (NanoTemper Technologies) according to the supplied labeling protocol. Labeled AdipoR2 was used at a concentration of ~ 20 nM. SCM-198 was titrated in 1:1 dilutions beginning at 25 μM, which contained 1.25% (v/v) DMSO. The samples were diluted in a MAT assay buffer. The mixture consisted of 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM MgCl2, and 200 mM KCl. DMSO should be at a final concentration of 1.25% to guarantee accuracy. All samples have the same DMSO concentration. The pieces were filled into premium-coated capillaries for measurement.

二

案例02.微量热泳动技术(MST)验证小分子与蛋白的结合

2024年，哈佛大学吴皓教授团队在《Cell》发表了题为“Small-molecule GSDMD agonism in tumors stimulates antitumor immunity without toxicity”的研究论文。该研究发现GSDMD激动剂-DMB可以通过降低肿瘤细胞中GSDMD的自抑制活性促进全长的GSDMD成孔，诱发肿瘤细胞焦亡进而发挥抗肿瘤功能[2]。

本研究中，作者首先通过脂质体泄露实验对100,000多种小分子进行筛选，发现了激活GSDMD孔形成从而触发脂质体泄漏的阳性化合物并筛选出24种较高活性化合物。随后，作者对这24种化合物进行体外脂质体泄漏实验(EC50值测定)、微量热泳动MST实验（化合物与GSDMD蛋白间的亲和力KD测定）、化合物对细胞活性进行评价，得到了活性最强的hit为小分子化合物DMB(图2A)。微量热泳动技术MST结果表明小分子DMB与GSDMD蛋白的结合能力较强，亲和力值为1.05 μM(图2B)。

图2 筛选GSDMD蛋白激动剂

Fluorescent protein labelling and microscale thermophoresis binding assay

Human GSDMD was labelled with AlexaFluor-647 using the Molecular Probes protein labelling kit. Ligand binding to GSDMD was evaluated using microscale thermophoresis (MST). Ligands (0.023–50 mM) were incubated with purified AlexaFluor-647-labeled protein (50 nM) for 30 min in assay buffer (20 mM HEPES at pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20). The sample was loaded into NanoTemper Monolith NT.115 glass capillaries and MST was carried out using 30% LED power and 40% MST power. KD values were calculated using the mass action equation and NanoTemper software.

三

参考文献

[1] Wang R, Chen Y, Han J, et al. Selectively targeting the AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3 axis by SCM-198 as a rapid-acting therapy for advanced acute liver failure[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 1-22.

链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-55295-7

[2] Fontana P, Du G, Zhang Y, et al. Small-molecule GSDMD agonism in tumors stimulates antitumor immunity without toxicity[J]. Cell, 2024, 187(22): 6165-6181. e22.

链接：

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00898-5

佰莱博生物MST检测服务的优势：

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(1)生物物理实验：

SPR、MST、ITC、BLI、DSF、CETSA、nanoDSF、MALS (动静态光散射)、AUC (分析型超离)、CD (圆二色光谱技术)

(2)生物化学实验：

Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3)细胞生物学实验：

小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)

(4)计算模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计