ITC等温滴定量热分子互作技术：CNS高分文章分享

引文

等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种经典技术，它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数(KD)、反应化学计量数(n)、焓(∆H)和熵(ΔS)。这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。ITC是唯一能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。ITC在自然状态下测定分子间结合的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对互作分子进行修饰。

仪器包含一个参照池和一个样品池。参照池通常加入纯水，样品池加入待研究对象中的一种(一般为大分子，如蛋白质)称之为被滴定物，而滴定器里则装有另一种研究对象称之为滴定物(例如化合物)。

在实验过程中，滴定物被可控地滴入样品池中(同时伴随充分混合)，每滴体积一般为0.5到2μL,滴定直到样品池中的滴定物浓度2-3倍过量于样品池中的被滴定物浓度。每次滴定会产生一个热量脉冲，通过对每一次滴定时热量变化值对浓度进行归一化处理后生成摩尔放热量（kcal/mol）对摩尔比率(配体/样品）作图，再选择拟合合适的结合模型（Binding Models），获取结合相关的亲和力(KD)、化学结合计量比(n)、焓变(ΔH)和熵变(ΔS)。

一

案例一 ITC在EDS1-SAG101蛋白与配体蛋白NRG1A或NRG1C互作研究中的应用

2025年2月，国际顶级期刊《Nature》以封面文章形式刊登了西湖大学柴继杰教授团队的突破性研究成果。题为：“Balanced plant helper NLR activation by a modified host protein complex”，首次解析了植物免疫系统核心元件NLR蛋白的独特激活路径。

研究团队通过多维度实验证实，植物体内的NLR免疫受体不仅可通过传统效应蛋白激活，还存在一条全新的非效应蛋白激活通路。更值得关注的是，研究首次揭示NRG1C蛋白通过特异性竞争结合关键信号复合体EDS1-SAG101，实现对辅助蛋白NRG1A免疫应答的动态调控机制。这一发现不仅完善了植物免疫应答理论体系，更为后续开发精准调控作物免疫反应的新型技术提供了关键理论支撑。

在这项研究中，为验证NRG1C对EDS1-SAG101的亲和力高于NRG1A，作者使用了等温滴定量热法（ITC）测量了激活的EDS1-SAG101与NRG1C或NRG1A的结合亲和力。ITC结果显示，NRG1C与EDS1-SAG101结合的解离平衡常数(Kd)约为43 nM，NRG1A（包含残基160-809，称为NRG1AΔCC）与EDS1-SAG101的亲和力约为4 μM，几乎是NRG1C与EDS1-SAG101结合亲和力的100倍（图1A）。NRG1C与EDS1-SAG101更强的亲和力表明，NRG1C能与NRG1A竞争结合EDS1-SAG101。

为证实这一推测，研究者采用了GST-pull down实验进一步的验证，采用纯化的EDS1-SAG101蛋白与NRG1AΔCC共同孵育，并加入不同量的NRG1C，然后确定结合到EDS1-SAG101的NRG1A的数量。如下图B所示，在没有NRG1C的情况下，EDS1-SAG101能有效的拉下NRG1AΔCC，但随着NRG1C蛋白量增加，结合到EDS1-SAG101的NRG1AΔCC数量逐渐减少。在2:1的NRG1C：NRG1AΔCC比例下，几乎未检测到与EDS1-SAG101结合的NRG1AΔCC，表明所有的NRG1AΔCC被NRG1C竞争出局。

图1 NRG1C和NRG1A与EDS1-SAG101复合物亲和力检测

ITC assay

EDS1–SAG101 was co-expressed with the RPP1 resistosome in insect cells and purified as described above. The binding affinities of EDS1–SAG101 with NRG1C or NRG1A∆CCwere measured using MicroCal PEAQ-ITC at 25 °C in buffer containing 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl and 3 mM DTT; 0.2 mM NRG1A∆CCor NRG1C was then injected (19×2.0 μl) at 150-s intervals into the stirred (750 rpm) sample cell (volume approximately 280 μl) containing 0.02 mM EDS1–SAG101.Curve fitting and calculation of the binding affinity of all titration data were analysed using MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software.

二

案例二 ITC在穗花杉双黄酮与配体蛋白PDE4互作研究中的应用

2019年，清华大学柴继杰研究组与英国塞恩斯伯里实验室Cyril Zipfel团队在《Nature》联合发表题为"Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptor complex"的突破性研究成果。该工作通过多学科交叉研究，系统阐明了植物信号转导中RALF23多肽被CrRLK1L类受体激酶FER与GPI锚定蛋白LLG2构成的异源受体复合物特异性识别的结构基础。

研究团队运用X射线晶体衍射技术，成功测定apo-FER、apo-LLG1及RALF23-LLG2-FER复合物等五个关键状态的三维结构。结合深入的生化分析与植物活体功能验证，研究揭示LLG家族蛋白（LLG1/2/3）可直接结合RALF23信号分子，并在配体诱导下形成全新互作界面，从而介导受体激酶FER的协同组装。这种动态的FER-LLGs异源复合物构建机制，为解释植物细胞如何精准识别胞外信号提供了结构范式。研究团队发现RALF23氨基端保守序列具有诱导FER-LLGs复合物形成的核心功能，基于此鉴定出多个新型FER-LLGs信号分子配体。此外，通过构象分析首次阐明LLGs羧基末端结构域的动态柔性特征对其特异性识别RALF家族配体的关键作用，这一发现为理解GPI锚定蛋白的功能可塑性提供了新视角。

在这项研究中，研究者利用等温滴定量热法（ITC）检测了FERECD，RALF23和LLG1之间的互作关系，ITC实验表明FERECD与LLG1之间无直接互作，而多肽RALF23可分别于FERECD，LLG1互作，结合的解离平衡常数（Kd）分别为1.52 μM（图2A，中间)，4.95 μM（图2A，右边）。并通过后续的免疫共沉淀一同证实了RALF23诱导了LLG和FERECD的互作。

为探究RALF23与LLG1的关键互作位点，研究者根据LLG1的蛋白结构数据设计了G123R，并结合ITC检测测得G123R与LLG1之间的解离平衡常数（Kd）为21.4 μM，较RALF23与LLG1的4.95 μM亲和力下降，从而证实LLG1的G123影响了RALF23的结合（图2B 中间）。作为拟南芥LLG1的同源物LRE，本身并不能结合RALF23，但在将它与LLG1的G123相同位置的R120突变为R120G后，能检测到LRE与RALF23之间的解离平衡常数为30.5 μM，尽管亲和力较LLG1有所降低。（图2B左边，右边）。

图2  RALF23与LLG1和FERECD互作检测

ITC

Binding affinities were measured using ITC200 (Microcal LLC) at 25 °C in a buffer containing 10 mM Bis-Tris, pH6.0 and 100 mM NaCl. Ligands (approximately 0.5 mM) were injected (20 × 2.0 μl) at 150-s intervals into the stirred (750 rpm) calorimeter cell (volume 250 μl) containing 0.05 mM receptors. Measurements of the binding affinity of all the titration data were analysed using the ORIGIN 7 software (MicroCal Software).

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(1)生物物理实验：

ITC、SPR、MST、BLI、DSF、nanoDSF、MALS(动静态光散射)、AUC(分析型超离)、CD(圆二色光谱技术)

(2)生物化学实验：

CETSA、Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3)细胞生物学实验：

小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)

(4)计算模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计

B18171330319 (南区)