ABPP+SPR表面等离子共振+CETSA+分子对接+pull-down揭示Balasubramide作用靶点

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ABPP技术介绍

基于活性的蛋白质谱（activity-based protein profiling，ABPP）是一种化学蛋白质组学方法，它结合基于活性的探针（activity-based probe，ABP）和蛋白质组学技术来鉴定活性小分子的蛋白质靶标，以帮助阐明活性小分子发挥作用的机理。

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ABPP主要实验步骤

1. 探针制备：活性分子探针的设计合成，以及探针活性鉴定

2. 将探针与总蛋白孵育（或与细胞孵育后提取总蛋白）

3. 上述孵育完成后，先后进行UV照射（使活性分子与靶蛋白共价相连）、 点击化学反应（给活性分子引入报告基团，如生物素）

4. 通过报告基团对靶蛋白进行富集鉴定

ABPP实验基本流程图

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高分文章案例分享

Advanced Science | 中国药科大学和广东药科大学团队基于化学蛋白质组学找到抗炎活性分子（+）3C-20的分子靶点——VDAC1

急性肺损伤（ALI）是一种以急性低氧性呼吸窘迫和非心源性肺水肿为特征的严重临床疾病，该疾病具有高发病率和高死亡率的特点，除了通过机械通气维持治疗外，目前尚缺乏有效的药物治疗方案。因此，针对急性肺损伤患者，发现新的治疗靶点及相应的先导化合物显得尤为迫切。

2024年11月18日，中国药科大学庞涛，广东药科大学林汉森团队合作在Advanced  Science上在线发表了题为“Discovery of Balasubramide Derivative with Tissue-Specific Anti-Inflammatory Activity Against Acute Lung Injury by Targeting VDAC1”的研究论文，该研究通过合成Balasubramide（巴拉舒布胺）衍生物的光亲和探针（+）3C-20-probe ，应用光亲和探针对RAW264.7细胞中蛋白进行“垂钓”，并通过质谱等手段分析鉴定，最终确定（+）3C-20通过与VDAC1蛋白的互作减轻ALI中巨噬细胞介导的炎症。

研究思路小结

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Balasubramide衍生物（+）3C-20与VDAC1蛋白相互作用

1.1 不同Balasubramide衍生物的合成及抗炎活性筛选

作者首先从黄皮叶（Clausena indica）中发现了一种天然的具有抗炎活性的八元内酰胺化合物—Balasubramide（巴拉舒布胺）。但由于其天然活性低、成药性差，作者试图通过对天然物质进行结构改造，得到具有较高抗炎活性以及良好药用性的化合物。作者对天然结构进行了一系列修饰，并对它们的抗炎活性进行检测，在这些衍生物中，作者通过细胞以及小鼠实验发现（+）3C-20拥有最高的抗炎活性以及较好的药代动力学特性。

图1 不同Balasubramide衍生物的抗炎活性鉴定

1.2 （+）3C-20光亲和探针合成及靶蛋白垂钓

作者基于（+）3C-20的结构，设计并合成了光亲和探针（+）3C-20-probe，以寻找其发挥抗炎作用的可能蛋白靶点。作者首先在RAW264.7细胞中利用荧光染料（TAMRA-PEG3-N3）原位测试了光亲和探针的标记效率。接着通过化学蛋白质组学（ABPP）来鉴定（+）3C-20的潜在靶点，具体流程为：先将光亲和探针与RAW264.7细胞进行孵育，随即使用365nm的紫外光照射，使小分子探针与靶点蛋白形成共价键，然后将细胞裂解提取总蛋白，通过点击化学反应（Click reaction）对小分子探针进行生物素化修饰，生物素化的靶蛋白就可以通过链霉亲和素磁珠富集，最后进行质谱鉴定。作者通过质谱鉴定获得了55个（+）3C-20潜在的靶点蛋白，通过与银染结果比对，作者验证了前5个药物可能作用的靶点，发现只有VDAC1蛋白能特异性的与（+）3C-20相互结合。

图2 化学蛋白质组学技术鉴定（+）3C-20作用靶点

1.3 VDAC1蛋白与（+）3C-20直接相互作用

为了进一步验证VDAC1蛋白与（+）3C-20的相互作用，作者通过体内和体外的竞争性pull-down实验证明，当存在未修饰的（+）3C-20时，（+）3C-20探针与VDAC1蛋白的相互作用减弱；通过CETSA（细胞热迁移）实验证明（+）3C-20能提高VDAC1蛋白的热稳定性；通过SPR（表面等离子共振）技术以及免疫荧光技术直接证明VDAC1与（+）3C-20存在相互作用。

图3 pull down、CETSA、SPR以及免疫荧光等实验证明（+）3C-20与VDAC1蛋白相互作用

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（+）3C-20通过抑制VDAC1蛋白的寡聚来发挥抗炎功能

在蛋白寡聚后，VDAC1蛋白能在线粒体外膜形成通道结构，导致线粒体DNA因线粒体应激而释放至细胞质内，进而引发炎症小体的一系列激活反应。通过Western blot检测发现，（+）3C-20 可以以剂量依赖性方式抑制LPS引发的BMDM细胞中VDAC1 的寡聚化；同时在脂多糖（LPS）预处理后，加入（+）3C-20并随即用ATP激活NLRP3炎症小体，细胞裂解液中剪切型caspase-1的含量降低，同时细胞上清液中的IL-1β p17和caspase-1 p20也呈现出浓度依赖性的减少。这些结果表明，（+）3C-20通过抑制VDAC1寡聚来发挥抗炎功能。

同时，作者进行了分子对接，预测显示VDAC1蛋白的G021、Y022和K028与（+）3C-20存在氢键作用，这三个氨基酸残基可能是（+）3C-20发挥功能的关键氨基酸位点，于是作者构建了三个点突变，发现（+）3C-20不能抑制Y022A和K028A的寡聚，表明Y022和K028是（+）3C-20发挥功能的关键氨基酸位点。

图4 （+）3C-20发挥抗炎功能的分子机制及与VDAC1相互作用的关键氨基酸位点验证

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（+）3C-20在小鼠及急性肺损伤患者外周血模型中的功能验证

此外，在后续的实验中，作者发现VDAC1缺乏可以改善小鼠急性肺损伤的症状，减少ALI小鼠肺中 NLPR3 炎性小体的激活，其效果与（+）3C-20给药或同时施用（+）3C-20、敲低VDAC1的效果相同。作者进一步从急性肺损伤患者中分离了外周血单核细胞（PBMC），建立了LPS诱导的炎症模型，用LPS刺激后，PBMC细胞质中的mtDNA显著增加，而（+）3C-20处理显著减少胞质mtDNA释放。同时，（+）3C-20治疗还抑制了LPS刺激的PBMC中TNF-α蛋白的上调和促炎因子的转录水平。此外，（+）3C-20下调了PBMC中VDAC1的转录水平，而不影响VDAC1的蛋白表达，表明 （+）3C-20通过减少VDAC1的寡聚化而不是其表达来发挥抗炎作用。总而言之，（+）3C-20作为VDAC1寡聚化抑制剂可以抑制ALI患者PBMC中胞质mtDNA的释放和炎症反应。

图5 小鼠及急性肺损伤患者外周血模型中（+）3C-20的功能验证

总结

本研究通过结构改造获得 Balasubramide 衍生物—（+）3C-20，体内外试验证实其可改善急性肺损伤，通过 ABPP（化学蛋白质组学） 技术确定VDAC1为其靶点。（+）3C-20可与VDAC1的Y022和K028氨基酸结合，抑制VDAC1寡聚化，阻断线粒体外膜上VDAC1寡聚膜孔的形成，从而抑制mtDNA的释放，限制NLRP3炎性小体激活引起巨噬细胞炎症反应。综上所述，这项工作为急性肺损伤治疗提供了新方向和潜在药物。

参考文献

佰莱博生物提供全方位的生物分子相互作用检测服务，涵盖生物物理、生物化学、细胞生物学以及计算机模拟等多个技术。具体服务内容如下：

(1) 生物物理实验：

ITC、SPR、MST、BLI、DSF、nanoDSF、MALS(动静态光散射)、AUC(分析型超离)、CD(圆二色光谱技术)

(2) 生物化学实验：

CETSA、Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3) 细胞生物学实验：

小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)

(4) 计算模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计

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