MST应用案例分享：验证蛋白与小分子化合物互作

佰莱博生物：一站式分子互作实验服务

01.

技术原理

MST(MicroScale Thermophoresis)微量热泳动技术基本原理：

溶液中的分子在温度梯度场中定向从高温区向低温区移动，不同分子由于其尺寸、水化层和电荷等物理化学性质的差异，其热泳动速率也各不相同。

采用MST技术检测分子间相互作用的基本原理：

检测时将互作中的一个分子进行荧光标记，在MST技术中称之为Targetz；与之互作的另一个分子称之为Ligand。Target分子与Ligand分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷等性质相对于Target分子的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于Target分子的热泳动速度变快或者变慢。

进行MST实验时将Ligand分子按照2倍的浓度梯度稀释配制16管溶液，然后和Target分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测(图1B)。检测时仪器中的红外激光束对毛细管的的检测区域正中心进行加热(图1B)，激光束周围的溶液形成温度梯度场，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，并且移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关。激发光激发Target分子上的荧光基团，通过发射光检测器记录温度梯度场中Target分子发出的荧光强度变化情况(图1C)，图1.C中的横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，红色曲线为MST-Trace。图1.D左图中每一条曲线是一根毛细管中的荧光强度实时记录曲线（MST-Trace），记录了温度梯度场中荧光强度随时间的变化。然后将荧光强度的数值做纵坐标，配体浓度做横坐标进行拟合作图，软件自动计算得到该结合的亲和常数 KD。

图1 微量热泳动技术(MST)原理

02.

案例

MST验证小分子药物与转运蛋白SLC19A2/3的结合

2024年，复旦大学联合中科院生物物理所在《Nature Communications》(一区，IF=14.7) 期刊上发表题为“Substrate transport and drug interaction of human thiamine transporters SLC19A2/A3”的论文。该研究揭示了SLC19A2/A3识别和转运维生素B1(硫胺素，thiamine)和维生素B6(吡哆醇，pyridoxine)及相关抑制剂的分子机制[1]。

微量热泳动实验 (MST) 结果表明：在pH 7.5条件下，维生素B1与SLC19A2蛋白的亲和力约为78.4 μM，维生素B1与SLC19A3蛋白的亲和力约为153.7 μM（图3a、3e），二者亲和力相当。然而，在pH 6.0条件下，维生素B1与SLC19A2/A3的亲和力显著增强，远高于pH 7.5时的水平（图3b、3e）。相对而言，维生素B6在pH 7.5时与SLC19A2/SLC19A3的亲和力明显高于在pH 6.0时的亲和力（图3d、3e）。这表明，维生素B1在酸性环境（pH 6.0）中与SLC19A2和SLC19A3的结合能力更强，而维生素B6则在中性偏碱性条件（pH 7.5）下表现出更高的亲和力。这种差异揭示了SLC19A2和SLC19A3在转运维生素B1和B6时受到pH值的差异化调节机制（图1a-1e）。

图1 在pH6.0，pH7.5条件下，微量热泳动技术(MST)测定维生素B1、B6与SLC19A2/A3的亲和力

SLC19A2/A3蛋白的亲和力

Microscale thermophoresis assay

Binding of SLC19A2 and SLC19A3 to thiamine, pyridoxine, fedratinib, erythromycin, thiamine pyrophosphate, metformin, amprolium were measured by MST experiment. The eGFP-tagged fulllength SLC19A2 and SLC19A3 were purified by size exclusion chromatography in the assay buffer (50 mM MES pH 6.0,150 mM NaCl, 0.01% DDM, 0.001% CHS). Peak fractions were pooled and diluted to 40 nM. Ligand stocks (250 mM thiamine, 200 mM pyridoxine, 125 mM fedratinib, 100 mM erythromycin, 90 mM thiamine pyrophosphate, 200 mM metformin, 600 mM amprolium) were diluted to a suitable concentration used in the assay buffer. For MST measurements, a series of 16 sequential 1:1 dilutions were prepared using assay buffer for each ligand, and each ligand dilution was mixed 1:1 with diluted protein to final protein concentration of 20 nM and final ligand concentrations in the μM to nM range. The samples were incubated for 10 min at room temperature, and then loaded into Standard Monolith Capillaries (Cat# MO-K022, NanoTemper Technologies). Measurements were carried out with a Monolith NT.115 device at 80% LED power and 40% MST power. Kd was determined using the MO. Affinity Analysis software (version 2.3, NanoTemper Technologies, Germany) is with the Kd fit function. Capillaries displaying aggregation or adsorption were excluded. Data of at least three independently pipetted measurements were analyzed and Kd is expressed as mean ± SEM. Binding curves were plotted by GraphPad Prism Prism 9.5.1 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA).

小佰说

目前，研究小分子药物与蛋白相互作用的常见的技术包括：CETSA、DARTS、小分子Pull-Down等，这些技术主要局限于定性检测小分子药物与蛋白之间的相互作用，无法定量分析结合的强弱，流程复杂、稳定性差且可能存在假阳性或假阴性的问题。

相比之下，微量热泳动技术(MicroScale Thermophoresis, MST)能精确测定药物与蛋白的亲和力，稳定性和重复性好，低浓度下测定分子间的结合不存在假阳性的问题，进一步验证了传统定性方法的实验结果，可与传统的方法形成优势互补。

佰莱博生物提供全方位的生物分子相互作用检测服务，涵盖生物物理、生物化学、细胞生物学以及计算机模拟等多个技术。具体服务内容如下：

(1) 生物物理实验：

ITC、SPR、MST、BLI、DSF、nanoDSF、MALS(动静态光散射)、AUC(分析型超离)、CD(圆二色光谱技术)

(2) 生物化学实验：

CETSA、Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3) 细胞生物学实验：

小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)

(4) 计算机模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计

联系电话：027-88316765

微信号：Yu13377873161 (北区)

B18171330319 (南区)