目的蛋白得率低
可能原因:
· 细胞裂解效率低,目标蛋白未充分释放
· 裂解液粘度过高(DNA/RNA未降解,干扰分离)
· 层析柱选择错误或纯化步骤繁冗损失
· 蛋白稳定性不好,如被蛋白酶降解或自身聚集沉淀
解决步骤:
1. 优化裂解条件:
引入非离子型去垢剂(如Triton X-100)增强膜蛋白释放。想具体了解他们更多内容的可以到www.sigmaaldrich.cn查看。
2. 降低裂解液粘度:
加入核酸酶降解核酸,减少干扰
3. 调整纯化步骤:
选择符合目的蛋白标签的亲和层析
选择合适规格和分辨率的色谱层析
4. 优化蛋白缓冲液
添加蛋白酶抑制剂,纯化过程在冰上操作
增加缓冲液离子强度/去垢剂浓度
2. 纯化后仍然杂蛋白多
可能原因:
· 标签结合效率低,非特异性结合较多
· 亲和层析洗脱条件不当,如咪唑浓度一步洗脱
· 宿主蛋白残留
解决步骤:
1. 减少非特异性吸附:
在结合缓冲液中添加竞争性分子(如低浓度咪唑、精氨酸)更换成特异性更好的标签
进阶方案:FLAG/HA短肽标签可减少空间位阻,配合对应单抗能实现更高特异性洗脱
2. 优化纯化步骤:
亲和层析后接离子交换再接色谱层析,提高分辨率
梯度洗脱代替一步洗脱,去除杂蛋白更有效
3. 降解宿主核酸或竞争性结合杂质:
添加Benzonase核酸酶,降解DNA/RNA
增加预清除步骤,裂解后离心取上清
3. 糖蛋白或修饰蛋白纯化困难
可能原因:
· 翻译后修饰导致电荷/结构异质性
· 传统层析方法分辨率不足
解决步骤:
1. 修饰特异性捕获:
使用凝集素层析(如ConA结合甘露糖基化修饰)
2. 增加纯化前处理:
先用切去糖基化后分析,降低复杂性
4. 蛋白检测如Western Blot / 质谱/免疫荧光灵敏度低可能原因:
· 目标蛋白特性限制,如产量低或丰度低
· 检测系统灵敏度不足
· 目的蛋白标签不合适
解决步骤:
1. 对目的蛋白进行富集:
免疫共沉淀(Co-IP)或亲和纯化预富集
超滤浓缩(10kDa截留膜)联合丙酮沉淀
2. 优化检测方案:
选择高灵敏度的检测抗体,使用高灵敏对的底物,使用信号放大系统
3. 更换目的蛋白标签
根据需求更换目的蛋白标签,如增加可溶性(-MBP)、增加特异性(-Strep)以及增强检测灵敏度(-FLAG或-HA)
进阶方案:His+FLAG组合用,纯化检测两手抓;c-myc标签+荧光抗体实时监测表达。
由此可见,蛋白纯化看似机械重复,实则需要精心搭配,纯化步骤顺序不同结果也会不同,纯化后的检测也至关重要。蛋白如此珍贵,得来不易,而我们默克作为科研界的老朋友,同样一直在蛋白纯化上为大家保驾护航,提供满足不同类型蛋白纯化要求的产品。
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