Nature Materials丨纳米凹坑图案化指导细胞迁移和组织化

PART1

研究背景

细胞与材料界面的相互作用在生物医学领域具有重要意义，尤其是在组织工程和再生医学中。细胞行为（如粘附、迁移、增殖和分化）受到细胞外基质的物理和化学性质的调控。近年来，研究者们通过设计具有特定化学性质和拓扑结构的表面来控制细胞行为。尽管已有大量研究关注细胞与纳米结构界面的粘附相互作用，但对于纳米结构界面如何通过排斥细胞来指导细胞迁移和细胞群体组织的研究相对较少。本研究通过多光子消融光刻技术在表面上制造具有不同长宽比和间距的纳米级“陨石坑”，探索这些纳米结构如何通过改变细胞的粘着斑大小和分布来影响细胞形态、迁移和定位。

PART2

结果与讨论

纳米结构的制造与表征

本研究利用多光子消融光刻技术制造了纳米级陨石坑模式的表面。通过飞秒激光脉冲诱导的光学击穿，研究者在石英表面上制造了具有不同长宽比的纳米陨石坑。这些陨石坑的尺寸和间距可以通过调整激光脉冲能量和聚焦透镜的数值孔径来精确控制。实验中使用了不同放大倍率的物镜（×100、×50 和 ×20），成功制造出直径从 500 nm 到 1000 nm、深度从 30 nm 到 350 nm 的纳米陨石坑。原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜（SEM）的表征结果显示，这些纳米陨石坑的边缘清晰，没有明显的熔化或材料流动现象，这为后续的细胞实验提供了理想的表面条件。

纳米陨石坑对细胞行为的影响

研究发现，纳米陨石坑的间距（pitch）对细胞的粘附、迁移和形态产生了显著影响。细胞在小间距（如 2 µm）的纳米陨石坑表面上表现出较低的粘附密度和较弱的粘附强度，而在大间距（如 8 µm）或未处理的平面上则表现出更高的粘附密度和更强的粘附强度。细胞在小间距表面上的形态更加细长，且粘着斑主要分布在细胞的前缘或后缘，这表明细胞在这种表面上的极化程度更高。此外，细胞在小间距表面上的迁移速度更快，但迁移的持续时间更短，这可能是由于细胞在这种表面上难以形成稳定的粘着斑。

细胞排斥效应与迁移模式

通过设计具有梯度间距的纳米陨石坑模式，研究者成功实现了细胞的定向迁移和细胞群体的组织。在梯度模式下，细胞倾向于从高密度的纳米陨石坑区域（小间距）向低密度的区域（大间距）迁移。这种迁移模式表明，细胞能够感知纳米结构的物理特性，并主动寻找更有利于粘附和迁移的表面区域。实验中观察到，细胞在梯度模式的表面上形成了清晰的排斥区域，这些区域的细胞密度显著低于其他区域。这种细胞排斥效应与纳米陨石坑的尺寸密切相关，较大的陨石坑（如 1000 nm 直径和 350 nm 深度）产生了更明显的排斥区域，而较小的陨石坑（如 500 nm 直径和 45 nm 深度）则几乎没有排斥效应。

细胞迁移的定量分析

为了深入理解细胞在纳米陨石坑模式表面上的迁移行为，研究者对细胞的迁移方向性、速度、持续时间和持续距离进行了定量分析。结果显示，细胞在梯度模式表面上的迁移方向性主要集中在 45°左右，这表明细胞倾向于沿着纳米陨石坑间距增加的方向迁移。与未处理的平面相比，细胞在梯度模式表面上的迁移速度显著更高，但迁移的持续时间更短。这些结果表明，纳米陨石坑模式通过干扰细胞的粘着斑成熟过程，促使细胞向更有利于形成稳定粘着斑的区域迁移。

纳米陨石坑对粘着斑成熟的影响

研究进一步探讨了纳米陨石坑如何通过影响粘着斑的成熟来调控细胞迁移。实验中观察到，细胞在小间距的纳米陨石坑表面上形成的粘着斑较小且不成熟，而在大间距或未处理的平面上形成的粘着斑则更大且更成熟。这表明纳米陨石坑的间距对粘着斑的形成和成熟具有显著影响。为了验证这一假设，研究者通过转染表达 Talin-1(405) 的质粒来激活细胞的整合素，从而增强细胞的粘附能力。结果表明，过表达 Talin-1(405) 的细胞能够在小间距的纳米陨石坑表面上形成稳定的粘着斑，并且迁移方向性消失，这进一步证实了纳米陨石坑通过干扰粘着斑成熟来调控细胞迁移的机制。

细胞迁移的调控机制

本研究还探讨了细胞迁移的调控机制，特别是细胞如何感知和响应纳米结构表面的物理特性。研究发现，细胞在纳米陨石坑模式表面上的迁移行为受到细胞内部机械信号的调控。例如，使用肌球蛋白 II 抑制剂 Blebbistatin 处理细胞后，细胞的迁移能力显著下降，且无法形成稳定的粘着斑。这表明细胞的迁移依赖于肌球蛋白 II 的收缩力，而纳米陨石坑模式通过干扰细胞的机械信号传导来调控细胞迁移。

纳米陨石坑模式的普适性

为了验证纳米陨石坑模式对细胞行为调控的普适性，研究者在另一种常用的细胞培养基质——组织培养聚苯乙烯（TCPS）上制造了类似的纳米陨石坑模式。尽管 TCPS 表面的激光消融过程中形成了边缘材料堆积，但细胞在 TCPS 表面上的迁移行为与石英表面相似，表明纳米陨石坑模式对细胞行为的调控具有一定的普适性。

细胞群体组织的应用前景

本研究的另一个重要发现是纳米陨石坑模式可以用于细胞群体的组织。通过设计具有特定图案的纳米陨石坑模式，研究者成功实现了细胞群体的定向迁移和组织。例如，通过制造具有平行线或圆形图案的纳米陨石坑模式，研究者能够引导细胞形成相应的细胞群体图案。这种能力为组织工程和再生医学提供了新的可能性，例如在生物材料表面制造具有特定形状或图案的细胞组织，以模拟天然组织的结构和功能。

结论与展望

本研究通过多光子消融光刻技术制造了纳米陨石坑模式的表面，并系统研究了这些纳米结构如何通过调控细胞的粘着斑成熟来影响细胞的迁移和群体组织。研究结果表明，纳米陨石坑的间距、尺寸和分布对细胞行为具有显著影响。通过设计具有梯度间距的纳米陨石坑模式，研究者成功实现了细胞的定向迁移和细胞群体的组织。此外，研究还揭示了细胞迁移的调控机制，并验证了纳米陨石坑模式在不同材料表面的普适性。这些发现不仅为理解细胞与纳米结构界面的相互作用提供了新的见解，还为组织工程和再生医学中的细胞调控提供了新的工具和方法。未来的研究可以进一步探索纳米陨石坑模式在不同细胞类型和生物材料中的应用，以及其在体内环境中的生物学效应。

文献链接：

https://doi.org/10.1038/NMAT4342