外周血单个核细胞（PBMCs）在ELISpot实验中的分离、冷冻和解冻指南

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外周血单个核细胞（PBMCs）至少在人样本中，是ELISpot和FluoroSpot实验中使用最广泛的细胞类型。PBMCs可以通过密度梯度离心（例如使用Ficoll-Paque）轻松从血液中分离。分离后的细胞可以直接使用，也可以选择进行冷冻保存，以便在后续时间点使用。这是一份关于如何最佳分离、冷冻和解冻PBMCs的详细指南。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离

对于全血的收集，市面上有各种带有不同抗凝剂的采血管可供选择。根据Mabtech的经验，使用柠檬酸盐和肝素的采血管最适合用于ELISpot实验。如果需要大量细胞，也可以从白细胞层（buffy coat）中制备PBMCs，白细胞层是在去除血浆和大部分红细胞后得到的白细胞浓缩物。

自备材料：血液样本（全血或白细胞层）；无菌的Ficoll-Paque；无菌的PBS或无血清培养基（例如RPMI 1640）；聚丙烯离心管：50ml和/或15ml，无菌；吸管和移液器；无菌巴氏吸管（塑料或玻璃）；自动移液器和无菌吸头；室温离心机

PBMCs的分离步骤：

1. 全血：用PBS将血液稀释2倍（例如，10ml血液+10ml PBS）。白细胞层：白细胞层中的细胞密度比全血更高，因此需要稀释更多（大约3倍）。

2. 准备含有Ficoll-Paque的离心管。根据血液体积，选择15ml管或50ml管。如果使用15ml管，加入5ml Ficoll-Paque；如果使用50ml管，加入15ml Ficoll-Paque。

3. 小心地将稀释后的血液轻轻加在Ficoll-Paque层的上方，避免破坏界面。对于15ml管，加入8ml稀释后的血液；对于50ml管，加入25ml稀释后的血液。**提示：** 在加样时，将移液管靠在管壁上，并倾斜试管。

4. 在室温下，以400×g的速度离心30分钟，离心过程中不使用制动。

5. 离心后，在Ficoll-Paque层上方会形成一层白色至灰白色的单个核细胞层。小心地用巴氏吸管收集单个核细胞，并将其转移到一个新的离心管中。或者，也可以先去除一部分血浆层，再收集单个核细胞。注意，不要将来自超过两个Ficoll管的细胞合并，并且保持体积（不超过试管体积的一半）。用PBS或无血清培养基将新管加满。

6. 通过离心新管10分钟（400×g）来洗涤细胞。

7. 弃去上清液，重悬沉淀，并加入PBS或无血清培养基。**提示：** 在重悬细胞时，先轻敲试管使细胞沉淀变得不那么紧密。然后加入1-2ml缓冲液/培养基，缓慢上下吸打溶液，再将试管加满。

8. 通过离心新管10分钟（400×g）来洗涤细胞。

9. 弃去上清液，重悬沉淀，并加入无血清培养基。

10. 记录体积，并取少量样本进行细胞计数。

11. 以400×g的速度离心10分钟来洗涤细胞。**提示：** 在这一步进行细胞计数。**提示：**经过Ficoll分离后，可能会存在残留的红细胞（RBC）和粒细胞。如果需要，可以使用市售的试剂来去除这些细胞。（例如“RBC裂解缓冲液”和“粒细胞去除剂”）

12. 如果您想立即使用细胞，弃去上清液，通过轻轻上下吸打，用适量的细胞培养基重新悬浮细胞沉淀。PBMCs现在可以用于基于细胞的免疫分析，如ELISpot、FluoroSpot和流式细胞术。如果您想冷冻保存细胞，则可参考如下“PBMCs的冷冻保存”部分。

2. 外周血单个核细胞（PBMCs）的冻存

标记冷冻管，并确保冷冻容器已准备好。将细胞在室温下长时间置于冷冻培养基中可能会对细胞活性产生负面影响。

自备材料：冷冻培养基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 20%胎牛血清（FCS）和10%二甲基亚砜（DMSO）。如果您的细胞适应无血清培养基，请使用7% DMSO； 冷冻管，例如1.8ml；聚丙烯离心管：50ml和/或15ml，无菌；冷冻容器，例如“CoolCell”或“Mr. Frosty”；自动移液器和无菌吸头；-80℃冰箱；-150℃冰箱或液氮罐

PBMCs的冻存步骤：

1. 弃去上清液（来自前一部分的第11步），并将细胞用冷冻培养基稀释至每毫升500万到2500万细胞的浓度。如果您使用的是无血清冷冻培养基，则应将细胞浓度调整至每毫升100万细胞。

2. 将细胞分装至冷冻管中，例如每管1毫升，并将冷冻管转移到冷冻容器中。确保通过持续重悬保持细胞处于悬浮状态。 **提示：** 对于1.8毫升的冷冻管，每管分装1毫升细胞悬浮液。对于其他尺寸的冷冻管，务必确保分装的体积小于最大容量，因为液体在冷冻过程中会膨胀。

3. 迅速将冷冻容器放入-80℃冰箱中，至少保存4小时，最多保存1周。

4. 将冷冻管从冷冻容器转移到-150℃冰箱或液氮罐中进行长期保存。

3. 外周血单个核细胞（PBMCs）的解冻

将水浴加热至37℃。提前将用于第2步的细胞培养基预热。在后续的洗涤步骤中使用的培养基保持室温即可。

自备材料：细胞培养基：RPMI 1640（含2 mM L-谷氨酰胺）+ 10%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、100 ug/ml青霉素+100 ug/ml链霉素；聚丙烯离心管：50ml和/或15ml，无菌；吸管和移液器；自动移液器和无菌吸头；室温离心机；37℃水浴；37℃、5% CO2培养箱

PBMCs的解冻步骤：

1. 迅速将冷冻管从冷冻保存处转移到37℃水浴中，解冻细胞直到仅剩小冰晶。**提示：** 如果打算解冻多个冷冻管，每次只解冻几个。冷冻培养基中含有DMSO，DMSO对细胞有毒，因此请尽快进行第2步。

2. 慢慢向冷冻管中加入0.5-1ml预热的细胞培养基，重悬细胞，并将细胞从冷冻管转移到15ml管中。用1ml细胞培养基冲洗冷冻管，并将其转移到15ml管中。用细胞培养基将管子加满。

3. 通过离心（300×g，10分钟）洗涤细胞。

4. 弃去上清液，轻敲管子使沉淀变得不那么紧密。通过缓慢上下吸打，用1ml细胞培养基重悬细胞。加入细胞培养基，使总体积达到15ml。

5. 以300×g的速度离心10分钟。

6. 弃去上清液，用1ml细胞培养基重悬沉淀。根据预期的细胞数量和所需的细胞浓度，加入额外的细胞培养基（例如5ml）。

7. 将细胞放入CO2培养箱中放置1小时。将盖子稍微打开。**提示：**利用这一个小时的空闲时间来清洗和封闭你的ELISpot/FluoroSpot板。

8. 孵育（细胞静置）后，重悬细胞并让任何聚集的细胞碎片沉淀（大约需要1分钟）。然后小心地将细胞悬浮液（不包括碎片）转移到一个新的15ml管中。**提示：** 每个15ml管最多加入两个冷冻管的细胞（或大约3000万到4000万细胞）。

9. 计数细胞并确定细胞活性。可以使用自动细胞计数器或通过显微镜使用台盼蓝染色来进行细胞计数。因为只有活细胞才能分泌分析物，所以在细胞计数时务必排除死细胞，如果可能的话，还要排除凋亡细胞。如果细胞浓度低于所需浓度，再次离心细胞，重悬并稀释至所需的体积。

ELISpot试剂盒

PBMCs细胞制备好后，即可准备进行ELISpot实验。Mabtech作为ELISpot领域研究专家，可提供高品质人的ELISpot试剂盒：

Mabtech

Mabtech 公司于1986年创办于瑞典斯德哥尔摩大学免疫学系，是一家欧洲的集研究，开发，销售，技术支持为一体的高科技免疫生物技术公司。Mabtech公司始终专业致力于研发新的单克隆抗体，生产创新的免疫试剂和销售高品质的全配套的免疫试剂盒。公司核心业务是致力于优化发展酶联免疫斑点法技术 (ELISpot)、荧光免疫斑点法技术 (FluoroSpot) 和酶联免疫吸附试验技术 (ELISA) 等免疫学方法。Mabtech公司的产品质量体系符合ISO 9001和ISO 13485国际标准。

作为Mabtech在中国的特约合作伙伴，艾美捷将为中国客户提供全面的Mabtech产品以及客户订制化服务。