​光学前沿 | 活体组织中深层动态的代谢和结构成像

基础研究到临床病理学，捕捉完整活体生物系统的代谢动态对生物医学至关重要。NAD(P)H和FAD是生物组织固有的内源性荧光团，通过NAD(P)H和FAD的无标记双光子自发荧光成像可实现细胞代谢活动的非破坏性、高分辨率和三维可视化表征。由于散射及离焦信号的影响，目前NAD(P)H成像很难突破300 µm的深度。在本期介绍的这项工作中，研究者证明了通过采用多模光纤（MMF）源在1100 nm波长处对NAD(P)H进行三光子（3P）激发，可以显著克服NAD(P)H成像的深度限制[1]。

图1a是激励源的原理图：重复频率为1 MHz、波长为1030 nm的超短脉冲在8.5 cm的 阶跃折射率 MMF（纤芯25 um，0.1 NA）中传输，并通过光纤整形器调制脉冲传播，从而提高光束质量并缩短脉冲宽度，最后在1100 nm处光谱滤波得到适用于NAD(P)H成像的光源。图1c 比较了MMF 光源与最先进的光参量放大器（OPA）所产生的图像（NAD(P)H/THG 使用来自OPA的750 nm/1300 nm和来自MMF的1100 nm），成像对象为小鼠须垫组织的同一部位，成像结果表明两组图像的信噪比（SNR）和分辨率相当。

光纤整形器的原理在此前已得到验证，改变致动器的位置可对光纤施加受控的宏观弯曲，改变非线性多模态脉冲的传播，进而在光谱、时间和空间特性上定制 MMF 输出(图2)。本文的成像装置通过整合三倍频成像的信号电平作为实时反馈，可主动调整致动器位置，以产生最适合 3P 成像的光谱-时间-空间曲线（图3）。图3显示经过致动器调整后，1100 nm波段能量增加了1.27倍，脉冲持续时间缩短了 1.43倍，光束空间轮廓得到了改善，成像质量大幅提高。

为了研究NAD(P)H成像的深度限制以及使用1100 nm光源扩展深度限制的有效性，作者用750 nm的OPA和1100 nm MMF光源分别对NAD(P)H进行2P和3P激发的自发荧光成像。两种光源的成像样本为三维微血管网络的同一部位。如图4所示，在表层（Z ≤ 200 µm），使用双光子荧光生成的NAD(P)H图像与使用1100 nm的三光子荧光的信噪比和分辨率相当。然而，随着成像的深入，由于存在焦外背景信号，双光子荧光的信噪比下降得更快。图4d和4e中量化了2P和3P非线性过程的图像劣化和信号衰减与成像深度的关系。

此前已经证实过采用1100 nm的超快激发源可以同时激发并区分多光子显微镜的四个模态，研究人员将这种显微镜命名为SLAM(simultaneous label-free  autofluorescence-multiharmonic）显微镜。本文利用MMF激励源驱动dSLAM(dynamic SLAM)显微镜，并检验其在在亚细胞水平对活体多细胞系统进行非侵入式深度代谢和结构表征的能力。图5展示了活体血脑屏障微流体模型350 µm×350 µm×500 µm图像堆栈，成像结果基于中心波长1100 nm、峰值功率超0.5 MW的MMF激励源。图5c—i表明，基于dSLAM显微镜能够很好地分辨人类血脑屏障微流控模型中的血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞，并能对这些多细胞相互作用、代谢状态和深度依赖性变化进一步分析与表征。

为了检验 dSLAM 捕获更快动态的能力，本文在体外跟踪了单核细胞的行为，以模拟活体血管网络中免疫细胞的招募过程。如图6以0.5 MHz的像素速率进行延时成像，帧频为 2 Hz，视场 (FOV) 为 0.12 × 0.12 mm，可同时监测多细胞代谢和运动行为。

本文利用基于MMF的波长转换来产生1100 ± 25 nm波段的高峰值功率脉冲，将NAD(P)H在活体工程人体多细胞微组织中的实际成像深度扩展到700 µm。成像深度的提高为观察更厚的三维组织结构和小型模型生物的代谢过程和结构特征提供了新的可能性。此外，利用紧凑型滑入式光纤整形器的 MMF，能以灵活的方式传输具有近高斯光束轮廓的高峰值功率脉冲，与以前的方法相比，具有微型化和广泛应用的潜力。

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