动物行为与光电专题（49）丨自由活动小鼠神经钙信号记录

小鼠头部固定装置/小鼠脑室显微观察固定器是神经科学研究中针对活体脑功能动态观测的核心设备，其创新性设计集精准定位、稳定固定与多模态兼容于一体。在双光子显微成像场景中，该装置通过预手术在小鼠颅骨表面埋植钛合金适配基座，实现了颅窗区域与显微镜物镜的快速精确定位耦合。

自由活动小鼠光遗传学抑制在双侧MEC注射AAV-eNpHR3.0-mCherry的小鼠上进行。将光纤植入到双侧MECII-DG环路上方，抑制光在光纤末端的能量为15mW。在水迷宫空间任务中，光遗传学抑制从动物下水前开始，直到小鼠到达逃生平台，或者开始任务后40s。

Morris水迷宫

采用Morris水迷宫作为小鼠空间导航与空间学习记忆的行为学任务模型。在一个直径120cm，高40cm的圆形水池中装入温度为20°C±1°C的水。水深度为11cm，水中加入不透明的氧化钛并混合均匀，使池中的水变为不透明状态。在距离池壁30cm的位置放入一个直径10cm，高度10cm的圆形逃生平台，平台淹没在不透明的水下。在池壁上贴有醒目的标记，作为小鼠找到逃生平台的空间参考。水迷宫正上方装有红外模式下工作的相机，能够对整个水迷宫场景进行录制。水迷宫周围用灰黑色窗帘围绕，减小外界对小鼠行为带来的干扰。

在所有的训练试验中，平台的位置都是固定的。每只小鼠每天进行4次训练，连续训练3天，每次训练间隔为15分钟。在每次训练，小鼠从随机的起始位置释放，在70秒的时间窗内被允许进行逃生平台的自由搜寻。如果小鼠在给定的时间窗内没有找到逃生平台，实验者小心将小鼠引导到逃生平台上。小鼠在逃生平台上停留20秒后被小心取出水迷宫，放置在休息台上用吸水纸小心吸掉多的水分，然后用电烤火炉加热保持温暖。小鼠被烤干后放入到饲养笼中休息，等待下一次训练。 

Morris水迷宫

（a）实验示意图（b）实验真实场景图

经过3天的训练，当小鼠能够连续在10秒内快速到达逃生平台，则被视为训练成功。训练成功后设计了一个不同时长线索暴露的实验，对训练好的小鼠进行了全程线索、1s线索和无线索的测试。全程线索是在整个任务过程中给小鼠提供正常的环境照明；1s线索从小鼠入水开始只给小鼠提供1s时间的环境照明，1s时间后将所有的环境照明关掉；无线索从小鼠入水前就关闭所有的环境照明，使小鼠处于一个完全黑暗的环境。

接着对小鼠进行新环境测试，采用一个完全不同的水迷宫对训练好的小鼠进行测试。新水迷宫为一个方形水迷宫，其颜色、形状、材质以及所处的环境都与原来训练用的水迷宫有明显区别。

在这些测试都完成后将逃生平台取出，通过统计小鼠在逃生平台所在象限搜寻的时间比例来衡量小鼠对逃生平台位置记忆的稳固程度，并记录MECII-DG环路钙信号的变化。小鼠从距离原逃生平台位置最远的地方开始任务，在水中搜寻80s后被取出。每只小鼠进行两次去掉逃生平台测试，记录的视频追踪运动轨迹，并进行统计分析。

八臂迷宫

本文同样采用了八臂迷宫行为学来测试小鼠的空间记忆。八臂迷宫由八根伸出来的8个放射状的臂和位于中心的平台构成。中心平台直径为40cm，每个臂的尺寸为50cm×10cm（长×宽），高度为8cm。在每个臂的末端都开有一个直径约2cm的小孔，可用来盛放饮用水，而在迷宫的中心看不到小孔中是否放有水。在八臂迷宫周围的墙面上放有明显的视觉线索，用于指示目标臂的位置。

八臂迷宫

（a）实验示意图（b）实验真实场景图

训练前三天开始给小鼠进行饮水控制，每天每只小鼠饮水量为1ml，并在下午5:00~6:00喂水。限水后第二天和第三天，小鼠被放到八臂迷宫中自由探索15min。第二天在每个臂的中央和末端放置一小滴水，使得小鼠能够对整个环境进行探索适应；第三天则在每个臂末端的小孔中放置约0.1ml水，使小鼠适应在小孔中喝水。在正式训练过程中，选择一个臂作为目标臂，在同一个小鼠接下来的所有训练中都集中在这个臂的小孔中放置饮用水作为奖励，每次训练放置的水量为0.1ml。小鼠从迷宫的中心开始任务，每天训练5次，训练时长为8天。小鼠的行为通过八臂迷宫正上方的红外相机记录下来，通过线下分析小鼠在找到目标臂末端的水之前进入错误臂的次数，以及所花时间来对小鼠空间记忆准确程度进行量化分析。 

旷场测试

为检测光遗传学抑制MECII-DG环路对一般的运动行为的影响，在旷场实验条件下对小鼠MECII-DG环路进行光遗传学抑制，观察小鼠运动在抑制期间是否存在异常。旷场实验场景为50cm×50cm的正方形盒子，实验对象为双侧MEC第2层注射AAV-CaMKII-eNpHR.0病毒的实验组和注射AAV-syn-eGFP或者AAV-syn-mCherry病毒的对照组。两组小鼠均在双侧MECII-DG环路上方埋置通光直径为200μm的光纤。整个实验过程持续20min，前两分钟的数据未纳入分析。后面的18min被分为6个时间段，每段持续3min。第1、3、5时段为抑制关时段，第2、4、6时段为抑制开时段。而在抑制开的时段内，每60s时间内的30s，激光器连续打开，在抑制关的时段内，激光器一直处于关闭状态。小鼠在旷场中的活动被红外相机录制，计算小鼠在不同时间段内的运动速度。

1）在小鼠水迷宫空间任务学习过程中记录MECII-DG环路轴突末梢的钙信号为了对小鼠空间学习过程中MECII-DG环路的活动进行研究，采用自主开发的用于轴突末梢记录的光纤光度仪在小鼠进行空间导航任务学习过程中，对该环路的轴突末梢进行钙信号记录。

2）小鼠在水迷宫导航任务中MECII-DG环路形成PTA活动

在小鼠进行水迷宫任务时，采用光纤记录的方式对MECII-DG环路的钙信号进行了实时检测。本文发现这个环路的钙信号随着学习的进行而发生变化，呈现出增强的趋势。在小鼠刚进行水迷宫训练时，MECII-DG环路中的整体活动水平较低，活动的模式为随机出现的瞬时增强的钙信号。而在训练好的小鼠中，该环路的钙信号不仅在幅度上大幅度增加，且呈现为持续活动，将其命名为任务关联持续活动（PTA）。PTA活动从小鼠开始任务快速上升到较高水平，一直持续，直到小鼠找到逃生平台后才降回到基线水平。 

在水迷宫任务学习过程中，小鼠MECII-DG环路钙信号发生变化

上图为来自一个小鼠的记录，左边为第一次训练，中间为第五次训练，右边为学会的状态。圆圈中的线条为小鼠搜寻的轨迹图，不同颜色与钙信号颜色的时间段相对应。下图为6个小鼠的平均，实线为均值，阴影为标准误，中间和右边的信号按照小鼠找到逃生平台的时间对横轴进行归一化。