ELISpot和FluoroSpot实验中刺激物的优化选择与应用

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要让ELISpot或FluoroSpot实验提供有价值的信息，通常需要在体外对细胞进行刺激。刺激物不仅可以用于识别抗原特异性免疫反应，还可以作为实验对照。选择合适的刺激物主要取决于细胞类型和实验的具体需求。刺激物可以是单克隆抗体、肽库、合成化合物，或者是从细菌或植物中提取的天然物质。Mabtech提供多种经过验证和优化的多克隆和抗原特异性刺激剂试剂，适用于ELISpot和FluoroSpot实验。其中，大多数试剂为单克隆抗体或肽库（我们称之为PepPools）。PepPools可用于实验对照，也可用于识别抗原特异性免疫反应。

针对特定研究问题的刺激

PepPools有两种形式：定义明确的肽库和扫描肽库：

扫描肽库：不需要事先了解表位信息，其设计目的是覆盖整个蛋白质或特定结构域。它们通常以15个氨基酸的肽段形式生产，且每个肽段之间有11个氨基酸的重叠，从而覆盖整个目标蛋白质。15个氨基酸的肽段能够刺激CD4+ T细胞，当加入细胞培养中时，它们可以被蛋白酶进一步修剪成较短的肽段，从而刺激CD8+ T细胞。因此，扫描肽库可用于刺激任何物种的任何T细胞。一般来说，如果您不确定研究群体中的HLA/MHC组成，扫描肽库是一个更安全的选择。

定义明确的肽库：在产品名称中会标明特定物种，它们包含针对特定HLA/MHC分子的已定义肽段。这些肽段已被Mabtech或其他研究者鉴定为免疫优势肽段，因此能够产生强烈的免疫反应。如果您确定研究群体中的HLA组成能够被覆盖，那么定义明确的肽库是首选。

Mabtech提供针对一些常见病原体的肽库，并且产品列表在不断增加。如果您正在考虑使用Mabtech的肽库进行研究，但尚未购买ELISpot或FluoroSpot试剂盒，可以查看Mabtech的Path Kits——这些是包含肽库的完整且经过验证的试剂盒。请注意，Mabtech的肽库可用于研究问题，但由于例如EBV（Epstein-Barr病毒）和CMV（巨细胞病毒）在人类群体中高度流行，某些肽段库也可以用作阳性对照。

为什么Mabtech有这么多针对SARS-CoV-2的肽段库？因为它们可以用于不同的目的并回答不同的问题。

SARS-CoV-2 (SNMO)肽库(货号3622-1) 是用于解答有关COVID-19免疫的一般性问题的首选产品。然而，如果您发现SARS-CoV-2 (SNMO)肽库没有涵盖您所需的HLA类型，那么SARS-CoV-2 (S1)扫描肽库(货号3629-1)将是一个更好的选择。拉霍亚Sette实验室（Yu等人，《细胞宿主与微生物》，2022年）的一项研究强调了如何通过分别检测针对刺突蛋白和非刺突蛋白的IFN-γ反应来区分疫苗接种和感染引发的免疫反应。因此，SARS-CoV-2 (NMO)肽库（货号3632-1）可以与SARS-CoV-2 (NMO)肽库（货号3632-1）结合使用，以区分SARS-CoV-2感染和疫苗接种。最后，SARS-CoV-2奥密克戎BA.1 (S1)，扫描肽库（货号3636-1）可用于评估对奥密克戎BA.1突变的反应。为什么Mabtech有这么多针对SARS-CoV-2的肽段库？因为它们可以用于不同的目的并回答不同的问题。

请注意，肽库小瓶可以合并使用，以便更好地契合当前的研究问题。也许您只想观察结核病（TB）的反应性，而不关心是哪种特定抗原引发了反应？也许您对CD4与CD8的反应不感兴趣，而只关心总的T细胞反应？也许您想合并肽库（例如EBV+CMV），以便在阳性对照中覆盖更多的HLA类型？这是可行的！唯一的风险是DMSO（二甲基亚砜）的浓度过高，可能导致细胞膜损伤并对细胞产生毒性。为了解决这个问题，请仅在第一个小瓶中加入40微升DMSO，然后将所有内容物转移到下一个小瓶中，如果需要合并三个小瓶，则继续转移到下一个。记得用PBS冲洗小瓶。

作为实验对照的刺激物

用于T细胞多克隆激活的常用试剂是植物血凝素（PHA）或佛波酯/离子霉素（PMA/Ionomycin）。然而，在Mabtech看来，抗原特异性刺激通常也更适合用于对照孔，因为这些试剂经过了很好的定义，并且能够诱导细胞更“生理学上正确”的激活。抗原特异性刺激的一个缺点是，它们可能并不适用于所有HLA类型或物种。

T细胞多克隆激活

某些选定的抗CD3抗体可以作为T细胞的多克隆激活剂。Mabtech提供针对人和猴CD3的单克隆抗体，这些抗体能够诱导多种细胞因子的释放。使用体外生产的单克隆抗体，确保了批次间低变异性——这比植物凝集素等试剂更具优势。

植物凝集素：植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白A（ConA）是强效的T细胞激活剂。目前，Mabtech不提供植物凝集素，但PHA和ConA可以从许多不同的供应商处购买，并且有不同效力的产品可供选择。

抗原特异性T细胞刺激

已知能够诱导特异性反应的抗原也作为阳性对照具有重要价值。ELISpot或FluoroSpot的一个主要应用领域是检测抗原特异性人CD8 T细胞产生的IFN-γ。为此，Mabtech开发了一种抗原特异性的阳性对照，即CEFRAS (CD8)肽库（货号3637-1）。Mabtech还提供用于刺激CD4 T细胞的CEFTA (CD4)肽库（货号3617-1），以及一个更全面的CEF版本，即CEF扩展肽库（货号3618-1）。这三种肽段库也可以用于流式细胞术。

CEFRAS (CD8)肽库（货号3637-1）能够刺激CD8+ T细胞产生例如IFN-γ、IL-2、颗粒酶B、穿孔素和TNF-α等细胞因子。该肽段库包含210种肽段，这些肽段是来自18种病原体的MHC I类限制性T细胞表位，包括柯萨奇病毒B4、人腺病毒5型、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒6型、人乳头瘤病毒、流感病毒A型、JC多瘤病毒、麻疹病毒、结核分枝杆菌、呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2、弓形虫、天花病毒和黄热病病毒。该肽段库旨在刺激T细胞，覆盖来自不同种族背景的广泛HLA类型。肽段在偶联后进行了封端处理。

CEF (CD8)肽库（货号3616-1）由23种病毒肽组成，能够刺激人CD8 T细胞产生主要为IFN-γ的反应，覆盖约90%的白种人。这些肽段包含来自巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I类限制性T细胞表位，旨在刺激具有多种HLA类型的供体的T细胞。它还能在许多个体的细胞中诱导穿孔素和颗粒酶B的反应。除了作为阳性对照外，CEF肽段库还适用于标准化程序。

CEF扩展肽库（货号3618-1）由32种病毒肽组成，能够刺激人CD8 T细胞产生主要为IFN-γ的反应，覆盖约90%的白种人。这些肽段包含来自巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I类限制性T细胞表位，旨在刺激具有多种HLA类型的供体的T细胞。它还能在许多个体的细胞中诱导穿孔素和颗粒酶B的反应。

CEFTA (CD4)肽库（货号3617-1）由35种MHC II类限制性病毒肽组成，这些肽段来自人巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）、流感病毒、破伤风毒素和腺病毒5型。CEFTA肽段库能够刺激人CD4 T细胞产生IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-13，推荐作为使用人外周血单个核细胞（PBMCs）进行ELISpot和FluoroSpot实验的阳性对照。

CD4和CD8细胞的分别耗竭，揭示CEF (CD8)肽库（货号3616-1）确实主要刺激CD8 T细胞。

多克隆单核细胞/树突状细胞刺激

Toll样受体（TLRs）的配体可以作为阳性对照来刺激单核细胞和树突状细胞。从细菌中纯化的脂多糖（LPS）通过TLR4发挥作用，是例如IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的强效刺激物。化合物R848是TLR7/8的配体，能够刺激例如IL-1β的分泌。

目前，Mabtech不提供LPS。Mabtech不单独提供R848，但它（连同IL-2）是StimPack(货号3660-1，StimPack: Memory B cells, human)的一部分，因此可以从Mabtech这里获得。

多克隆B细胞刺激

记忆B细胞在分泌可检测量的抗体之前需要多克隆刺激。这些细胞可以使用StimPack(货号3660-1，StimPack: Memory B cells, human)或StimPack（货号3661-1，StimPack: Memory B cells, mouse）进行刺激；这是一种合成化合物R848（TLR 7/8激动剂）和重组IL-2的混合物。

Mabtech

Mabtech 公司于1986年创办于瑞典斯德哥尔摩大学免疫学系，是一家欧洲的集研究，开发，销售，技术支持为一体的高科技免疫生物技术公司。Mabtech公司始终专业致力于研发新的单克隆抗体，生产创新的免疫试剂和销售高品质的全配套的免疫试剂盒。公司核心业务是致力于优化发展酶联免疫斑点法技术 (ELISpot)、荧光免疫斑点法技术 (FluoroSpot) 和酶联免疫吸附试验技术 (ELISA) 等免疫学方法。Mabtech公司的产品质量体系符合ISO 9001和ISO 13485国际标准。