制药公司的一个偶然的发现：不起眼的玻璃培养皿可能就是隐藏的凶手！

有时候，不起眼的一个玻璃培养皿可能就是隐藏的凶手！

辅助生殖技术ART的进步为无数不孕不育家庭带来了希望。自1978年人类首例试管婴儿诞生以来，全球已有超过900万新生儿通过ART技术孕育。ART也广泛应用于畜牧业，以提高繁殖效率。为了提高ART的成功率，科学家们在培养基、方法和设备方面投入了大量精力。

然而，在体外培养胚胎的过程中，除了光照、温度、pH值和培养基等已知因素外，实验室环境中的一些隐形杀手也可能悄然影响着胚胎的健康发育。近期日本的一家制药公司Fuso相关团队发表在《Biology of Reproduction》上的一篇研究揭示了一个令人意外的风险因素：从实验室玻璃器皿中析出的微量锌Zn可能对人类和动物的胚胎发育产生毒害作用。

意想不到的发现

研究团队最初的发现源于对不同公司生产的注射器过滤器的评估。惊讶地发现，某些含有玻璃纤维的过滤器会显著降低小鼠胚胎的囊胚形成率。如果在培养前用培养基清洗这些过滤器，这种负面影响就会消失。

随后，研究人员进一步考察了常用的玻璃底培养皿。实验结果显示，在所有三种品牌的玻璃底培养皿中培养的小鼠胚胎都出现了发育停滞在二细胞阶段（二细胞阻滞）以及囊胚形成受阻的现象。通过改变培养液与玻璃的接触面积，研究人员发现胚胎发育速率的降低与接触面积呈正相关。更有力的证据是，在玻璃表面覆盖一层聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜以避免直接接触后，即使是在毒性最强的玻璃底培养皿中，囊胚形成率也恢复到了对照组水平。

研究还发现，用于操作胚胎的玻璃毛细吸管也会对胚胎发育产生负面影响，且影响程度与使用的吸管数量成正比。

那么，玻璃器皿中究竟是什么物质在作祟呢？

研究团队对在玻璃底培养皿中孵育过的培养基进行了详细的成分分析。结果显示，除了丙酮酸和半胱氨酸含量有微小变化外，培养基中其他28种成分的含量与未接触玻璃的培养基相比没有显著差异。这暗示毒性并非由培养基成分被玻璃吸附或变性引起，而是由于有毒物质从玻璃中析出。

通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析，从玻璃底培养皿和玻璃过滤器中析出的物质中检测到了硼（B）、钛（Ti）、锌（Zn）、溴（Br）和钡（Ba）等微量元素。在表现出毒性的培养皿和过滤器中，硼和锌的含量显著高于其他元素。

为了确定哪种元素是主要的毒性来源，分别在培养基中添加了硼酸和氯化锌，并观察了对小鼠受精卵发育的影响。结果表明，即使在高于玻璃析出浓度五倍的情况下，硼酸也没有表现出明显的毒性。然而，仅仅6 μM的氯化锌就显著抑制了胚胎的发育。进一步的实验证实，锌会随着时间的推移从玻璃底培养皿中渗入培养基，并在4天后达到6 μM以上的浓度。

也就是说，从玻璃制品中析出的锌是导致胚胎发育受阻的主要原因之一。

胚胎发育的哪个阶段对锌最为敏感？

在受精后不同时间点向培养基中添加了6 μM的氯化锌，从受精开始到早期二细胞阶段是小鼠胚胎对锌最为敏感的时期。来自近交或远交品系的小鼠胚胎，这些品系在体外更容易发生二细胞阻滞，对锌的敏感性更高。

通过活细胞成像技术，锌浓度依赖性地增加了胚胎在染色体分离过程中出现错位、滞后和微核形成的频率（染色体分离异常），以及与细胞质分裂异常相关的多核细胞的出现（细胞质分裂失败）。此外，锌还增加了胚胎发生有丝分裂停滞和二细胞阻滞的几率。

锌如何扰乱胚胎基因表达？

对处于二细胞和囊胚阶段的小鼠胚胎进行了RNA测序分析。基因表达谱分析显示，许多在合子基因激活（ZGA）过程中特征性激活的逆转录转座子（如MERVL、ORR1A）被锌抑制，表明ZGA受到抑制和/或延迟。然而，MMVL30-int的表达却显著升高。

在二细胞阶段，锌处理组中有277个基因上调，90个基因下调。大多数上调的基因（如Hoxa1、Hoxb9、T和Fgf8）在正常的胚胎植入前阶段几乎检测不到，并且富集了发育调控因子。下调的基因包括那些在ZGA过程中特异表达的基因，如Zscan4a，它是维持基因组完整性和激活MERVL所必需的Zscan4c的同源基因。

相反，在囊胚阶段，锌处理组仅有10个基因上调，19个基因下调。上调的基因主要与锌代谢相关，包括锌输出转运蛋白（Slc30a1/ZnT1和Slc30a2/ZnT2）和金属硫蛋白（Mt1和Mt2）。在二细胞阶段，这些锌缓冲因子的表达水平远低于囊胚阶段，并且没有受到锌暴露的诱导。

进一步的机制研究发现，在二细胞阶段被锌上调的基因的启动子区域（转录起始位点±1 kb范围内）显著富集了锌指转录因子的结合基序，例如金属调节转录因子1（MTF1）。这表明，锌暴露可能通过影响锌依赖性转录因子的活性，从而导致早期胚胎基因表达的异常。

如何避免呢？

进一步研究了在囊胚培养过程中锌暴露对后续足月发育的影响。将形态正常的桑葚胚或囊胚移植到假孕小鼠体内后，锌处理组的出生率与对照组相当。然而，培养过程中桑葚胚或囊胚的形成率却呈现锌浓度依赖性的下降 ，在锌处理组中，获得一个新生儿所需的受精卵数量显著增加。尽管如此，由锌处理过的胚胎发育而来的新生儿的出生体重却呈现锌浓度依赖性的增加。

由于锌是二价阳离子，尝试通过在培养基中添加螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）来对抗锌的毒性。将锌补充培养基（6 μM Zn）中的EDTA浓度提高到100 μM后，桑葚胚或囊胚的形成率显著提高，发育速度也与对照组相当。添加EDTA还显著改善了在使用有毒注射器过滤器和玻璃底培养皿进行培养时的囊胚发育率。

如果在锌敏感的时间窗口（直到4-8细胞阶段）仅用EDTA处理胚胎，那么桑葚胚或囊胚的发育率、出生率、胎盘重量和出生体重都与对照组相当。已知具有锌螯合活性的牛血清白蛋白（BSA）的补充也改善了从玻璃毛细吸管中排出的培养基中的囊胚发育率和锌补充培养基中的发育延迟。这些结果表明，在胚胎植入前发育的适当时间补充EDTA和/或BSA可以保护胚胎免受锌毒性，从而实现正常的足月发育。

会不会对人类胚胎同样的毒性效应？

最后，将组蛋白H2B-mCherry mRNA 注射到剩余的人类胚胎的晚期原核期，并通过活细胞成像观察了它们在存在氯化锌的情况下发育到囊胚阶段的过程。由于伦理和技术限制，人类胚胎的锌添加时间相对于小鼠和牛的实验有所延迟。在含有48 μM ZnCl2的培养基中培养的人类胚胎在显微形态、囊胚形成率或包括染色体分离和细胞质分裂在内的几个卵裂参数方面与对照组没有显著差异。然而，锌处理组胚胎中直接卵裂（一种以每次卵裂中多次细胞质分裂为特征的异常卵裂类型）的发生率显著高于对照组。这些结果表明，从玻璃中析出的锌对人类胚胎的发育都具有不可忽视的影响。

尽管塑料器皿和过滤消毒的培养基的广泛使用已经减少了胚胎学家和研究人员对玻璃仪器的依赖，但在许多配子和胚胎培养方法中，玻璃仪器仍然不可或缺。

从胚胎培养中使用的玻璃器皿中析出的锌会对胚胎发育产生不利影响。尽管锌是生命必需的微量元素，但在体外培养环境中，过量的锌却可能成为胚胎发育的隐形杀手。未来，还需要进一步研究玻璃析出的其他成分以及用于粘合玻璃和塑料的粘合剂对胚胎发育的影响，以确保体外胚胎培养的安全性。