【Echelon】脂质-蛋白互作检测方式及工具大盘点

每日生物评论

资讯/技术/知识/智慧

www.bio-review.com

当细胞生物学家第一次发现可能有一种脂质参与他们最喜欢的途径时，这有点像在马路对面找到一堵墙(就像当脂质学家在他们的路上找到一种蛋白质一样……)。

由于脂质的不同性质，大多数细胞生物学家都害怕在他们的研究过程中不得不面对这种情况。好消息是，有一些简单的方法可以帮助克服这一障碍，使研究特定途径中的脂质变得更容易。在这里，我想介绍一些脂配体相互作用研究的分析和准备工具。

1. 覆盖试验Overlay assays-鉴定与给定蛋白质相互作用的脂质

这些分析方法允许鉴定一种或多种脂质与给定蛋白质相互作用。

与Western-blot原理类似，它们的原理是在表面涂上各种类型的脂质，这些脂质将与已知的蛋白质接触，这种蛋白质将被标记或抗体临时检测到。脂质的载体通常是硝化纤维素膜(图1)。与点印迹法一样，需要优化一些实验参数(如缓冲液、蛋白质纯化或蛋白质浓度)。

当可用蛋白质的数量有限时，小的“覆盖分析格式”可以用少于0.5 mg的蛋白质进行检测。这是一种简单的方法来测试一种感兴趣的蛋白质对各种脂质的结合能力!

为了检查蛋白质对各种类型的脂质的相对亲和力，硝基纤维素阵列被标记为每种脂质的梯度。几个相同的阵列可以证明在测试单特异性或多特异性蛋白质有用。该技术显示出高特异性(图2)，结果甚至比ELISA试剂盒更干净，再次强调了实验条件优化的必要性。

对于那些对膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白质的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各种类型的脂质共价涂覆(称为COVA板)。用于高含量筛选的微阵列板格式允许您在单个板上测试具有不同脂质的几种蛋白质(亲和性)。平板的每孔都有9种不同的脂质，用于检测先前标记或通过免疫检测的蛋白质。图3所示的是一个蛋白质结构域(已知与两种不同的脂质相互作用)。对于前面介绍的设置，需要优化蛋白质浓度。

2. 下拉试验Pull-down assays-发现一种已知脂质的蛋白质伙伴

对于相反的实验设置，当您想要识别已知脂质的蛋白质伴侣时，琼脂糖为基础的下拉试验等制备技术将是您的最佳选择:

*琼脂糖珠包被确定的脂质可以被进一步孵育与细胞裂解液，上清液，重组蛋白…

* 然后相互作用的复合体通过离心将它们拉下来。

它允许分离脂质结合蛋白的数量适合进一步鉴定和表征。它经常与细胞裂解液一起用于“捞出”脂质对偶物(图4)。

3. 漂浮试验Floatation assays-用于更高特异性的蛋白质-脂质相互作用

当你在寻找更高特异性的蛋白质-脂质相互作用时，另一种基于脂质富集脂质体(用作脂质/配体相互作用的基质支持)的制备方法是可用的。

与GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超离心)类似，脂质体预结合到脂质配体上，将沿着超离心制备的葡萄糖梯度分成几个部分分布(图5)。

覆盖试验Overlay assay的脂质互作工具

. PIP Strips – 研究磷脂酰肌醇(PI)与哪些蛋白互作：

PIP StripsTM是一种2 x 6 cm的疏水膜，包含8种磷脂和7种其他重要的生物脂类，每个斑点有100 pmol的脂类。通过一个简单的蛋白质-脂质覆盖实验来确定脂质-蛋白质之间的相互作用。这为研究人员提供了一种方便的方法来确定他们感兴趣的蛋白质是否与一种或多个结合的脂质相互作用。

PIP Strips试纸条脂类与斑点分布：

. PIP Array – 研究脂质&蛋白互作灵敏度:

通过前期PIP Strips筛选，我们可以确定目标蛋白与8种磷酸肌醇及其它7种重要磷脂是否存现结合。如果目标蛋白与8种磷酸肌醇存在结合，如何进一步检测其结合强度或者结合灵敏度呢?

PIP Array – Lipid-Protein Interaction Assay

PIP Array是一种4 x 5 cm的疏水膜，包含8种磷酸肌醇，提供7种含量的标准品：100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 pmol。通过一个简单的蛋白质-脂质覆盖实验来确定脂质-蛋白质之间的相互作用强度和灵敏度。

PIP Array，PIP脂质蛋白结合芯片斑点分布：

．Membrane Lipid Strips – 研究脂质和哪些膜蛋白互作

Membrane Lipid Strips是一种2 * 6 cm的疏水膜试纸条，包含了细胞膜中常见的15种具有不同生物功能的重要脂质，每种脂类含量均为100 pmol。通过一个简单的蛋白质-脂质覆盖实验（PLO）来确定脂质-蛋白质之间的相互作用。这为研究人员提供了一种方便的方法来确定他们感兴趣的蛋白质是否与一种或多个结合的脂质相互作用。

脂膜试纸条Membrane Lipid Strips，斑点分布：

Echelon

Echelon 提供1200+精品特色产品，集中围绕磷脂，磷脂酰肌醇相关的脂质产品，多肽，抗体，活性/抑制剂筛选分析试剂盒，以及筛选结合的PIP strip，Lipid Strips/Arrays  ，为研究治疗诸如癌症、糖尿病、炎症、感染和心脑血管疾病专家提供全面有效工具。