水凝胶的药物释放实验该如何设计？

为实现药物的缓释、控释和迟释，研究者们开发了各种材料，并结合不同剂型实现特定目的。在众多的材料中，水凝胶因其独特的理化性质引起了人们对其在药物传递应用中的关注。首先，水凝胶良好的生物相容性是其能够载药并进入生物体内完成药物释放的先决条件。其次，水凝胶独特的三维网络结构以及水凝胶在水环境中对亲水性小分子的亲和力，可以用以将药物添加到其凝胶基质中，通过合适的释放机制，水凝胶能在长时间内维持局部的高药物浓度，释放机制可以基于扩散、溶胀、化学或者其他环境刺激、降解等。下面，就水凝胶载药特性的研究进行了详细的讲解。

水凝胶的药物释放

1、药物包封率测定

常见的载药方法有两种：将药物或装载有药物的脂质体、纳米颗粒、微球等直接加入水凝胶前体溶液中，再使前体溶液凝胶化。先制备好水凝胶，然后将水凝胶浸没于溶有药物的溶液中，使药物进入水凝胶。

包封率是指水凝胶中载有的药物量与载药过程中投入的所有药物量之比。由于包封药物的方式不同，包封的药物性质不同，测定药物包封率的最佳方法往往需要经实验验证才能确定。包封率测定的关键是将包封药物和未包封的游离药物分离，再利用光谱、色谱等分析手段检测包封药物或游离药物的浓度。常用的包封率测定方法有以下两种。

1.1离心法

比较适合用于测定通过第二种载药方式构建的水凝胶材料的药物包封率。

首先在载药之前确定药物溶液的总质量m0，载药完成后将水凝胶从药物溶液中取出，测定剩余药物溶液的体积记为v1，将剩余的药物溶液搅拌均匀后，取3ml的药物溶液4000rpm离心。离心后取上清用酶标仪或HPLC等方法，利用标准曲线测定药物浓度，记为C1，药物包封率的计算公式如下：

药物包封率=(m0-C1*V1)*100%

在测定脂质体的药物包封率时也可以采用离心法，主要有低速离心法、超速离心法以及超滤离心法。

低速离心法适用于脂溶性药物，其工作原理是脂溶性的游离药物不溶于溶解脂质体所需的水相介质，而悬浮在体系中，采用相对较小的离心强度和较短的离心时间，这些未溶的游离药物会因离心力的作用而沉降，但脂质体仍存在于上清液中，从而实现分离。

超速离心法要求离心转速大于20000r/min，离心时间一般要长于30 min。离心过程中因空气摩擦产热，需使用控温离心机。与低速离心法刚好相反，超速离心法中脂质体最终存在于沉淀中。由于脂质体和不溶的游离药物会一起沉降下来，无法实现二者的分离，所以此法适用于水溶性较好的药物的测定，可保证游离药物仍存在于上清液中。此外应注意较强的离心力作用可能会导致微粒聚集，破坏脂质体双分子层结构，导致药物发生泄漏。

超滤离心法是将脂质体放入配有超滤膜的超滤管中，在适宜的转速下离心，游离药物在离心力的作用下可通过超滤膜，而脂质体则被截留，从而实现二者的分离。超滤离心法多用于测定水溶性药物脂质体的包封率。然而“浓差极化”现象的存在限制了超滤法的应用。浓差极化现象是由于在超滤过程中，溶剂和小分子溶质能透过超滤膜，而大分子溶质被截留在膜内，这就会导致超滤膜表面的大分子溶质浓度升高，引起膜附近的渗透压增加，阻碍溶液继续向超滤膜方向扩散，进而降低了溶剂和小分子物质的膜透过率。

1.2释放法

比较适合用于测定通过第一种载药方式构建的水凝胶材料的药物包封率。

首先确定加入水凝胶前体溶液中药物的总质量m0，将载药后的水凝胶用PBS冲洗两遍，将水凝胶置于V1 ml合适的溶剂中，让药物完全释放出来，此时应根据水凝胶自身特点选择不同的释放条件，如酸碱度、温度等。注意容器应该密闭，防止水分蒸发。取3ml的药物溶液4000rpm离心后，取上清测定药物浓度，记为C。药物包封率的计算公式如下：

药物包封率=(C*V1)/m0

2、体外释放研究

药物的体外释放行为受药物本身因素和外界因素的影响。药物本身因素包括药物溶解度、晶型、粒度分布等，外界因素包括释放度测定的仪器装置、释放介质、转速等。体外释放度试验是在模拟体内条件下（如温度、介质的pH值、搅拌速率等），测定制剂的药物释放速率。主要实验过程如下：将载药水凝胶置于释放介质中，维持一定的温度和搅拌速度，每隔一段时间取一定量溶液测定浓度，并补充相同体积的释放介质，直至药物不再释放为止。根据不同时间点药物浓度进行累计药物释放量计算，并绘制药物缓释曲线。

2.1标准曲线的绘制

在计算药物的体外缓释累积释放率时，样品的浓度指标是根据标准曲线计算出来的，所以最先进行的应该是绘制药物标准曲线，否则后面的实验结果无从谈起。

2.1.1检测方法

在绘制标准曲线前，应该确定药物的检测手段。常用的检测仪器有紫外分光光度计、高效液相色谱仪和荧光分光光度计。

紫外分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于定性和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。进行标准曲线绘制时会选择光谱曲线中的最大吸收峰作为药物的特征吸收峰，并对不同浓度下的标准品进行测试，利用特征吸收峰的吸收值绘制标准曲线。

高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。因此比较适用于缓释液中组分复杂的情况。该测试方法利用标准品的出峰时间标识特定组分。在色谱图中，峰面积与溶液浓度成正比。

此外，对于上述两种方法均不适用的药物，可以选择对其进行荧光分子标记，通过荧光分光光度计测定荧光强度进行标准曲线绘制。

2.1.2标准样品配制溶剂

标准样品进行配制时选择的溶剂应与最终测试的样品的溶剂一样，避免溶剂带来的测试结果的偏差。

2.1.3标准样品浓度范围

设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖所要检测实验样品的浓度，即最终测试样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

在配制标准品溶液时，最好先配制一个高浓度母液，再用倍比稀释法配制其他浓度标准品溶液。并且在测试时，按照浓度递增的顺序进行测试，以减少高浓度对低浓度样品的影响，提高准确性。

2.1.4标准样品数量

用于绘制标准曲线的样品数一般不少于5个，以免出现偏离点后无法剔除数据。绘制出的标准曲线相关系数应大于0.99。

2.2药物释放试验

2.2.1样品准备

一般将载药水凝胶放入透析袋，再置于释放介质中。尤其是一些物理交联或可降解的水凝胶材料，在缓释过程中会破碎，如果不用透析袋，会导致水凝胶部分损失，导致数据不稳定。浸提的容器应密闭，避免液体挥发。

透析袋的截留分子量（MWCO）应根据水凝胶及药物分子量进行选择，保证药物可透过透析袋但水凝胶的组分不可透过。

样品数量应不少于3个，且每个样品质量应尽量保持一致。

2.2.2释放介质选择

释放介质应能充分模拟人体内使用环境，可参照体外降解试验中的浸提介质选择。一般推荐选用水性介质，包括水、稀盐酸（0.001~0.1mol/L）或pH 3~8的醋酸盐或磷酸盐缓冲液等；对难溶性药物通常不宜采用有机溶剂，可加适量的表面活性剂（如10%十二烷基硫酸钠等）；必要时可考虑加入酶等添加物。

2.2.3释放介质用量

释放介质的用量应该能够满足漏槽条件。漏槽条件是指药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，满足药物溶解-吸收的过程，漏槽条件起到了修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的3～5倍。

2.2.4释放条件

一般在恒温37±0.5℃下，进行试验。如果做发热后退热药物的缓释、肿瘤部位的药物缓释，可根据应用部位条件调高温度。如果做体表的药物缓释，温度应在32±0.5℃，以模拟表皮温度。

不同的振荡或搅拌条件对药物的释放速度也有影响。一般不推荐过高或过低转速，推荐50r/min。

2.2.5时间点选择

应做预实验摸索药物的释放速度，再确定时间点。以缓释药物为目的的水凝胶的释药曲线应至少有3个时间点，第一点为开始0.5-2小时的取样时间点，用于考察药物是否有突释；第二点为中间的取样时间点，用于确定释药特性；最后的取样时间点，用于考察释药是否基本完全。以控释药物为目的的水凝胶的释药曲线的取样时间点不得少于5个。而以迟释药物为目的的水凝胶可根据应用需求设计释放度的取样时间点。

2.2.6取样

取3mL缓释溶液，经针头式过滤器过滤后，进行测试。注意，每次取样后需补加等量的释放介质。

2.3累计释放量计算

药物的累计释放量计算公式如下：

Qn=Cn*V0+(C1+C2+C3+……+Cn-1)*V

其中，Qn是第n个取样点的累积释药量；Cn是第n个取样点的浓度；V0是释放介质体积；V是每次的取样体积。

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