凝胶过滤法分子量测定

凝胶过滤法分子量测定

凝胶过滤法分子量测定是一种用于分析分子量及其分布的色谱技术，广泛应用于生物大分子如蛋白质、多糖和聚合物等的研究。其基本原理是基于分子在多孔材料中的排阻效应，通过分子大小的差异实现分离。较大的分子由于不能进入凝胶颗粒的孔径，先于小分子通过色谱柱，从而根据洗脱体积推测出分子量。

一、原理与机制

凝胶过滤法分子量测定的核心在于使用特定的多孔介质，通常是交联的葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。这些介质具有特定的孔径大小，允许分子在穿过色谱柱时按大小顺序分级分离。分子量不同的分子在流经柱中的路径长度和时间不同，从而实现分离。流动相一般选择不与被分析分子发生相互作用的缓冲液，以确保分离仅基于分子大小。

二、实验步骤

1.柱的准备：

选择合适孔径的凝胶并进行平衡，以配合目标分子的大小范围。装柱时应尽量避免气泡和不均匀装填，以免影响分离效果。

2.样品的制备：

将待测样品溶解于流动相中，必要时进行预处理去除颗粒物或聚集体，保证样品的均匀性。

3.进样与分离：

精确量取样品注入色谱柱上端，并以恒定速率引入流动相。样品在柱内进行分离，较大分子先从柱底流出，而较小分子则被滞留在孔径内。

4.凝胶过滤法分子量测定的检测与分析：

使用紫外检测器、示差折光检测器或光散射检测器等在线检测流出物，通过记录洗脱曲线获得洗脱体积。根据已知分子量标准品绘制的校准曲线，可以推算出未知分子的分子量。

三、优势与局限

凝胶过滤法分子量测定由于其不破坏样品、分离条件温和、可同时获得分子量及其分布等特点，成为研究大分子溶液行为的常用方法。然而，其分辨率相对较低，对于彼此大小相近的分子，可能难以实现有效分离。此外，样品的吸附和柱的限制也可能导致误差。

四、应用领域

凝胶过滤法分子量测定广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。通过这一方法，可以分析蛋白质复合物的聚集态、酶的纯化以及抗体的分离纯化等。此外，聚合物化学中常用其进行聚合物分子量及分散度的测定，为材料性能研究提供必要的数据支持。