Nat Neurosci：单细胞测序揭示揭开大脑“马赛克”的秘密

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《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。

《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。

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局灶性皮质发育不良II型（FCDII）是一种导致难治性癫痫的皮质发育畸形。FCDII起源于发育过程中发生的体细胞激活突变，这些突变主要发生在mTOR信号通路相关基因中，导致皮质分层异常以及出现异常的巨细胞。目前尚不清楚哪些细胞类型携带致病突变，以及这些突变如何影响细胞类型特异性的转录程序。

基于此，2025年4月30日索邦大学Stéphanie Baulac研究团队在nature neuroscience杂志发表了“Single-cell genotyping and transcriptomic profiling of mosaic focal cortical dysplasia”揭示了单细胞基因分型与转录组学分析在局灶性皮质发育不良中的应用。

在本研究中，作者结合多种具有空间分辨率的单核基因分型和转录组学方法，对FCDII患者的手术切除皮质样本进行了分析。在不同类型的细胞中检测到了突变，包括谷氨酸能神经元和星形胶质细胞，其中一小部分突变细胞表现出巨细胞特征。此外，还鉴定出了在突变和非突变的FCDII细胞中均存在的细胞类型特异性转录异常，涉及突触功能和神经发育相关的通路，这些异常可能与癫痫的发生有关；而在巨细胞中则观察到线粒体代谢通路的紊乱。综上所述，这些发现揭示了FCDII中细胞自主性和非细胞自主性的特征，为未来的精准医学治疗提供了潜在依据。

图一 FCDII中突触和神经发育通路的细胞类型特异性失调

本研究旨在通过多种转录组学方法，分析一组同质的局灶性皮质发育不良II型组织样本中细胞类型特异性的转录异常，以揭示与癫痫相关的变化及mTOR通路驱动的病变，并寻找潜在的疾病标志物。研究人员对10名因药物难治性局灶性癫痫接受手术的儿童患者的冷冻皮质组织进行了单核RNA测序，并纳入3名无癫痫的年龄匹配尸检对照以及8名来自先前研究的神经正常对照。患者携带MTOR、RHEB或DEPDC5基因的体细胞突变，其突变等位基因频率（VAF）在3%至17%之间。通过UMAP降维和细胞标记基因分析，识别出七种主要脑细胞类型：谷氨酸能神经元（GluNs）、GABA能中间神经元（IN-MGE/CGE）、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）、小胶质细胞和内皮细胞。尽管未发现所有患者共有的新细胞簇，但部分FCDII患者的谷氨酸能神经元有所富集。进一步分析显示，不同细胞类型的差异表达基因（DEGs）存在显著差异，其中谷氨酸能神经元和星形胶质细胞受影响最明显，而GABA能中间神经元变化最小。GO富集分析表明，这些DEGs涉及神经发育、突触功能和神经递质传递等通路，显示出强烈的细胞类型特异性病理机制。例如，在谷氨酸能神经元中观察到GRIN1 和 PRRT2 的下调以及 GLUL 的上调，提示该类神经元中谷氨酸信号传导异常。总体而言，这些结果揭示了FCDII癫痫组织中具有细胞类型特异性的分子调控异常，可能反映或促进了神经回路功能障碍和癫痫发作。

图二 FCDII突变细胞中的细胞类型特异性转录失调

为了识别由mTOR激活突变引起的、具有细胞自主性的基因表达通路变化，作者将患者样本中的突变核与仅检测到参考等位基因的核进行比较。分析仅限于至少包含10个突变细胞的细胞谱系：谷氨酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在KEGG数据库中，有14个转录本为mTOR通路的一部分。谷氨酸能神经元中表现出最多的失调基因，然而，GO功能富集分析揭示了不同细胞类型之间具有统计学意义的生物学差异。在突变核和参考核中，富集的GO条目主要涉及线粒体功能与结构、代谢、呼吸作用和胞吐作用。同样地，在突变的星形胶质细胞中也观察到线粒体代谢和转运相关GO条目的富集，而突变的少突胶质细胞则未显示显著的GO富集。这些结果表明在突变的神经元和星形胶质细胞中存在细胞类型特异性的代谢通路异常。进一步发现，来自患者的参考核（即非突变细胞）与对照组之间的这些失调基因表达水平相似，这表明这些转录变化是突变细胞所特有的，并且在个体间具有一致性，尽管所分析的细胞核数量有限。此外，已有研究报道，在FCDII小鼠模型中，邻近突变细胞的非突变神经元也可能因非细胞自主机制而出现兴奋性增强的现象。为了探究突变细胞对其周围环境的潜在影响，将患者样本中的非突变谷氨酸能神经元（Ref. GluNs）与对照组的GluNs进行了比较。结果显示，一些参与突触传递和神经元投射发育调控的基因表达上调；其中约90%的基因在突变GluNs与对照细胞核之间的比较中也表现为上调。这一发现表明，突触通路的变化广泛存在于突变和非突变神经元中。类似的非细胞自主效应也在胶质细胞中被观察到。作者的研究揭示了FCDII中存在两种关键过程：突变细胞中发生的细胞自主性机制，影响线粒体功能；更广泛的环路水平变化，影响突变和非突变神经元的功能。

图三 DNs和BCs属于谷氨酸能神经元和星形胶质细胞谱系，并表现出代谢失调

本研究综合利用激光捕获显微切割转录组测序（LCM–seq）、Visium空间转录组学和MERSCOPE高分辨率靶向基因分析等多种方法，系统揭示了FCDII中异常神经元（DNs）和气球样细胞（Balloon Cells, BCs）的分子特征。研究发现，DNs在分子水平上与GluNs相似，表达NEFM、SNAP25等与神经递质转运相关的基因，并富集线粒体功能相关基因（如VDAC1、COX7A），同时表现出凋亡相关基因的上调；而BCs则更接近星形胶质细胞，表达VIM、CRYAB等胶质标志物，并富集囊泡组织和细胞迁移相关基因。空间分布分析显示，DNs主要分布在各皮质层的谷氨酸能神经元区域，而BCs则呈弥散状分布，类似星形胶质细胞模式。进一步整合多组学数据并结合免疫荧光、电子显微镜等技术验证发现，DNs中存在线粒体数量增加及结构异常（如肿胀、空泡化），提示mTOR信号通路过度激活导致的线粒体功能障碍可能是FCDII的重要分子机制。这些结果为理解DNs和BCs的分子身份及其在疾病发生中的作用提供了新的视角。

总结

该研究提供了关于FCDII细胞和分子复杂性的关键见解，揭示了DNs中线粒体功能的异常。FCDII组织中mTOR信号的过度激活似乎加速了与细胞衰老相关的过程，例如线粒体能量产生和细胞衰老本身，并抑制了受损线粒体的自噬清除。因此，针对细胞衰老和线粒体功能的治疗可能为FCDII患者提供一种有前景的新疗法，未来或可作为侵入性神经外科切除手术的替代选择。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41593-025-01936-z