David Baker 团队最新研究，利用蛋白质序列生成模型实现重叠基因设计，成功率极高

作者：田小幺

编辑：李宝珠

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美国华盛顿大学 David Baker 团队近期利用先进生成模型，通过合成 OLG 设计研究，从工程化角度验证其可行性。研究团队针对 2 个蛋白家族设计重叠序列，编码高度有序的从头设计蛋白结构，计算机模拟与实验验证均显示出极高成功率。

1977 年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在解析 ΦX174 噬菌体基因组时，首次发现了一个颠覆认知的现象：这个仅 5.4kb 的 DNA 分子编码的蛋白质总长度，远超其物理容量限制。测序结果揭示，两对基因通过不同阅读框架共享同一 DNA 区域——这种被称为重叠基因（OLG）的现象，在病毒世界中极为普遍。例如，乙型肝炎病毒 3.2kb 基因组中，50% 区域被多对重叠基因覆盖，超过半数已知病毒至少含有一个 OLG。

这种突破直觉的基因组设计，暗藏着病毒的生存智慧：当病毒在宿主细胞内争夺有限空间时，OLG 通过「基因叠罗汉」策略，让单个核苷酸同时参与两个密码子编码，在紧凑序列中实现功能叠加。桑格团队的发现开启了相关研究，后续研究表明，OLG 编码的蛋白质常具有高序列简并性（degenerate），其氨基酸序列容错性使两种功能蛋白能在同一 DNA 链共存。更关键的是，即使需要形成明确三维结构的蛋白质，也能通过序列编排，在不同阅读框架中实现折叠兼容。

然而，核心疑问始终存在：标准遗传密码下，氨基酸序列简并性能否支持任意功能蛋白对在重叠框架中折叠？当核苷酸需兼顾双重编码时，蛋白质折叠的序列空间是否被严重限制？

美国华盛顿大学 David Baker 团队近期利用先进生成模型，通过合成 OLG 设计研究，从工程化角度验证其可行性。研究团队针对两个蛋白家族设计重叠序列，编码高度有序的从头设计蛋白结构，计算机模拟与实验验证均显示出极高成功率：在重叠约束下，可变阅读框架（alternative reading frames）不仅能容纳明确三维折叠，同时其结构稳定性与功能完整性与非重叠序列相当。

相关研究成果以「Design of overlapping genes using deep generative models of protein sequences」为题，已在 bioRxiv 发表预印本。

论文地址：

https://doi.org/10.1101/2025.05.06.652464

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数据集：整合多维度数据资源与分析方法

为解析遗传密码可塑性及其在蛋白质设计中的应用，研究整合多维度数据资源与分析方法，构建从理论设计到实验验证的完整研究链条。

在遗传密码随机化研究中，该研究基于氨基酸置换（amino acid permutation）与密码子重排（Codon shufflers）策略，生成 1,000 种替代密码子组合。这一数据集通过明确的算法设计保障了样本多样性与均匀性，为评估密码子重排的功能影响提供了统计学基准。

同时，研究选取 3 个具有代表性的二级结构目标蛋白，构建 9 组成对组合，在控制变量的前提下实现实验条件的标准化，有效连接遗传密码变异与蛋白质结构功能的关联性分析。

在蛋白质结构域序列分析环节，该研究从 Pfam 37.0 数据库提取种子序列，通过随机抽样截取长度 100 氨基酸的子区域，并利用马尔可夫模型生成保留 k-mer 分布的合成蛋白序列。该方法融合生物信息学筛选与统计建模，既保留天然蛋白质的序列特征，又通过引入可控随机变量创建对照样本，为后续分析提供了兼具自然属性与人工设计特征的创新数据集。

在蛋白质语言模型嵌入分析中，研究人员提取 ESM2、ESM3 和 ProstT5 的隐藏层特征，经位置平均后通过 UMAP 算法投影至二维空间。通过精准设定 n_neighbors = 15 等参数，高维序列特征被转化为直观的拓扑图谱，在保留序列相似性结构的同时，为跨模型比较提供了统一的可视化框架，展现了计算生物学与数据可视化的前沿结合。

在实验验证阶段，研究人员对 192 个重叠基因进行克隆重组，生成 384 种框架位移蛋白变体。实验严格控制关键参数：37°C 培养 20 小时确保大肠杆菌表达系统稳定，6M 盐酸胍梯度复性方案保障包涵体蛋白正确折叠。这种从分子设计到纯化表征的全流程量化控制，不仅提升了研究结论的可重复性，更为蛋白质工程提供了标准化实验范式。

OLG 的克隆重组示意图

基于生成模型的 OLG 设计：多框架兼容的序列同步优化方法

该研究开发了一种计算算法，有效应对重叠基因（OLG）设计中因编码框架相互依赖导致的序列空间受限难题，实现了两个蛋白序列适应性的同步优化。

在算法设计层面，研究整合了 EvoDiff-MSA 和 ProteinMPNN 等生成模型。前者基于 MSA Transformer 架构，通过自回归扩散目标训练，能以目标蛋白多序列比对（MSA）为条件生成设计序列；后者作为结构条件生成模型，可在给定三维结构时设计对应蛋白序列。两类模型均采用逐位置掩蔽与约束采样策略，生成了涵盖多种偏移量和框架排列的重叠序列库。

如下图 A 所示，针对 5 种可变阅读框架（+1、+2、-0、-1、-2）的相位约束，该研究提出逐帧（Frame）迭代采样策略。

在同一核苷酸序列中编码一对蛋白质的 5 种可能的可变阅读框架

如下图 B 所示，通过分析 -0 框架的氨基酸兼容性矩阵发现，参考框架中单个位置平均存在 2.6 种兼容氨基酸选择，形成 52ⁿ（n 为序列长度）种潜在重叠序列对，凸显遗传密码简并性带来的设计空间。借助蒙特卡洛近似（Monte Carlo approximation）量化其他框架自由度（degrees of freedom），如下图 C 所示，结果显示 +1 和 -1 框架自由度较高（分别约 2.8 和 2.9），而 -2 框架因密码子简并性利用效率低，自由度显著受限（约1.4）。

二维兼容性矩阵和蒙特卡洛近似图

最终，如下图 D 所示，算法通过系统扫描序列位置（Scan order），在每次扫描中结合相邻氨基酸约束动态更新联合概率（joint probability）矩阵，经多轮迭代后确保生成的重叠序列对满足框架的兼容性（compatibility）。该策略可扩展至含相位偏移的复杂框架，通过偏置扫描顺序优化设计质量，为生成模型的迭代解码（iterative decoding）提供了关键约束条件。

设计 OLG 的约束迭代采样算法示意图