因为太穷，出来挣钱！

摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promeg

因为没钱，所以拼命赚钱，

因为太穷，所以必须挣钱，

没有钱，拿什么养家糊口，

没有钱，拿什么维持感情！

不是我们太现实，

而是社会逼着你不得不现实。

柴米油盐需要钱，

人情往来需要钱，

吃喝玩乐需要钱，

不挣钱，如何在这个社会立足！

你要明白一个道理，

你可以没有权，但是必须要有钱，

你可以长丑点，但是钱包要鼓点。

在这个现实的社会，

不是看脸就是看钱！

穷在闹市无人问，富在深山有远亲，

贫寒之时无人理，风光之日众人围。

餐桌酒局富人狂，穷人低头坐边上，

杯酒先敬有钱人，没钱之人不敢随。

钱多金多朋友多，名大势大圈子大，

有钱有肉兄弟广，遇事求助无一人！

三穷三富过到老，大起大落看清人，

权势在身蜜语真，没了钱权怨恨深，

为官三日人求你，离官一日你求人，

锦上添花为物质，雪中送炭为真心。

是真是假用钱试，是敌是友难一回！

钱，是生活必备品，

我们辛苦的赚钱，

不是因为眼里只有钱，

不是因为心里只爱钱，

而是不想因为没钱，

让家人吃苦受罪，

让自己低三下四。

我们累死累活的干，

就是希望有朝一日，

父母孩子需要我时，

我能拿出钱来，

而不是只有内疚和眼泪！

现实的社会，不得不努力，

用钱的时代，不得不赚钱，

没有钱，努力赚，踏实干，

坚强独立，才是唯一的选择，

好好挣钱，才是唯一的出路！

你可以哭，但不可以怂，

你可以丑，但不可以穷！

致每一个走在奋斗路上的人，

加油，朋友！