HOXA9重编程增强子分布促进白血病形成

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(18)30378-7

基因的时空表达存在染色质水平以及顺式调控元件的多层次调控。远端调控增强子是一种顺式调控元件，其表观调控异常参与肿瘤的恶性转化1。在大多数急性白血病（acute myeloid leukemia，AML）中，不同致癌基因驱动同源框转录因子HOXA9异常表达2。约50%的AML和急性淋巴细胞白血病存在HOXA9高表达3，这与MLL1基因的重排以及NPM1c的突变等相关4, 5。HOXA9的结合位点包含HOX、PU.1、RUNX1和CEBP等骨髓转录因子的保守序列，同时具有激活增强子的表观遗传特征，例如H3K4me1和H3K27ac6。然而，尚不清楚HOXA9对于激活增强子的表观遗传特征的建立是否起关键作用以及这种功能在正常造血过程和HOXA9驱动的白血病转化中是否具有保守性。在本文中，该研究小组发现HOXA9在骨髓细胞和B祖细胞中的过度表达导致显著的增强子重塑，并出现白血病特异性的新增强子；作为先锋因子，HOXA9首先结合在新增强子形成位点，继而招募CEBPα和MLL3/MLL4复合体建立表观遗传特征；此外，在体敲除MLL3/MLL4封闭增强子位点H3K4甲基化同时抑制HOXA9/MEIS1介导的白血病形成。因此，靶向HOXA9介导的增强子重塑或是一种治疗HOXA9高表达白血病的有效策略。

一

主要细胞系

HMM细胞：指的是过表达HOXA9/MEIS1转化的骨髓性白血病细胞；

HMB细胞：指的是过表达HOXA9/MEIS1转化的祖B淋巴白血病细胞；

本文使用正常造血细胞：包括短期或长期的造血干细胞（long- and short-term hematopoietic stem cells，LT-HSC和ST-HSC）以及包括多能祖细胞（multipotent progenitor，MPP）、常见的淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor，CLP）、常见的骨髓祖细胞（common myeloid progenitor，CMP）、粒细胞-巨噬细胞（granulocyte-macrophage，GMP）和巨核红细胞在内的祖细胞以及终末分化的细胞；

MLL-AF9细胞：过表达MLL-AF9的HOXA9/MEIS1转化的骨髓性白血病细胞；

E2A-HLF细胞：过表达E2A-HLF的HOXA9/MEIS1转化的骨髓性白血病细胞。

二

实验结果

1，HOXA9在骨髓和淋巴白血病细胞中结合激活的增强子

为确定HMM细胞和HMB细胞中HOXA9的结合位点，研究工作者针对HA-HOXA9进行ChIP-seq，如图1A，在HMM细胞中，大多数HOXA9结合位点（＞90%）出现在基因间或基因内的区域，相反，只有6.2%的HOXA9结合位点出现在基因的启动子区域和其他转录区域（例如，5’ UTR，3’UTR和外显子）；相似地，在HMB细胞中，70%的HOXA9结合位点出现在基因间或基因内区域，而26%的HOXA9结合位点出现在启动子区域。有趣的是，在HMM细胞和HMB细胞中，HOXA9结合位点富集激活增强子的表观遗传特征：高水平的H3K4me1和H3K27ac，低水平的H3K27me3（如图1B）。如图1C，少于20%和2%的HOXA9结合位点分别具有待完成的增强子特征（例如，只有H3K4me1）或已完成的增强子特征（H3K4me1/H3K27me3），其中具有代表性的ChIP-seq结果（Pax5和Tgfbr3）如图1D。研究工作者进一步分析了HOXA9结合位点在HMM细胞和HMB细胞中的细胞系特异性，如图1E，在HMB细胞中，HOXA9结合位点富集B细胞特异性的转录因子EBF1和TCF3结合序列，而在HMM细胞中，HOXA9结合位点富集骨髓特异性的转录因子CEBP和ETS结合序列。这些结果提示HOXA9在造血细胞中起着调控增强子的作用，其特异性结合决定于细胞系特定的转录环境。

Figure 1 在HMB和HMM细胞中HOAX9与激活的增强子结合

2，HOXA9/MEIS1介导白血病形成中增强子重塑

为确定HOXA9诱导的白血病转化是否涉及增强子分布的改变，研究工作者分析了H3K4me1在HMM细胞和HMB细胞与正常造血细胞中的分布情况：如图2A，聚类分析揭示HMM和HMB细胞分别源自骨髓细胞和祖B细胞；如图2B，与正常造血细胞相比，HMM和HMB细胞中H3K4me1分别呈现白血病特异的增强子富集（Cluster 1和Cluster 2），分别占比4.7%和6.6%；如图2C，与正常骨髓细胞相比，HMM细胞中3760个增强子获得H3K4me1，而8056个增强子失去H3K4me1，代表性的区域如图2D；如图2E，大多数H0XA9富集在获得H3K4me1的基因组区域。因此，HOXA9过表达显著改变白血病细胞中增强子分布且产生白血病特异的增强子。

Figure 2 HOXA9/MEIS1介导白血病细胞增强子重塑

3，HOXA9结合两种类型的增强子并起着不同的作用

为探索HOXA9在白血病形成中的直接功能，研究工作者比较HMM细胞和骨髓祖细胞（myeloid progenitor，MP）中HOXA9结合位点相同区域H3K4me1的情况。如图3A，HOXA9结合位点存在两种不同的富集：（1）在HMM细胞和MPs中4643个位点具有相似的H3K4me1（研究工作者称其为physiological enhancers，PE）；（2）在HMM细胞中存在764个位点获得H3K4me1（研究工作和称其为de novo enhancers，DE）。基因本体论分析揭示与PE不同的是，DE高度富集胚胎发育相关通路（如图3B）。RNA测序结果显示HOXA9过表达和抑制分别影响PE和DE相关基因表达，如图3C，DE相关的基因在HMM细胞中显著上调而在抑制HOXA9后显著下调；相反，PE相关的基因整体水平上在HMM细胞中以及抑制HOXA9后均无明显变化。DE相关的基因表达变化与H3K4me1变化一致，在没有HOXA9结合时，H3K4me1也显著减少（详见补充数据S5E）；相反，抑制HOXA9时，PE处H3K4me1上调（如图3D）。HOXA9过表达和抑制在PE和DE中不同作用促使研究工作者检测HOXA9是否分别调控DE和PE处其他转录因子的结合，研究工作者针对转录因子CEBPα进行ChIP-seq，如图3E，在HMM细胞中DE处CEBPα结合显著增加而在HOXA9抑制后显著降低；相反，在HMM细胞和MP细胞中PE处CEBPα结合显著富集，但不受HOXA9抑制的影响。为确定HOXA9在DE处是否作为先锋因子，研究工作者在HMM细胞和MP细胞中进行ATAC-seq，如图3F，与MP细胞相比，HMM细胞中HOXA9包围的DE处染色质开放显著增加。因此，HOXA9结合两种类型的增强子并起着不同的作用。

Figure 3 HOXA9调控两种不同类型的增强子

4，HOXA9转化通过DE激活原始的转录程序

如图4A，在HMM细胞和HOXA9in细胞中，334个基因和1069个基因分别与764个DE和4643个PE相关，且存在表达差异，其中，2/3的DE相关基因（226个）在HMM中上调而且在HOXA9抑制后下调；相反，大多数PE相关基因（603个）在HMM中下调而且在HOXA9抑制后上调。通路分析发现，如图4B，与其他组基因不同的是，第一组（group I）基因（226个）富集组织发育及形态发生相关基因；相反，第二组至第三组基因富集了DE和PE相同的通路。图4C展示了选择性表达DE和PE相关的HOXA9靶基因以及对应H3K4me1变化，其中DE相关的基因（如Igf1、Bcl2和Erg）已被揭示参与血液恶性系统恶性肿瘤形成。

Figure 4 HOXA9通过重新形成增强子调控基因表达

为确定HOXA9转化细胞中DE的作用，研究工作者聚焦于Aldh1a3基因。如图5A，Aldh1a3在HMM细胞中表达增加而在HOXA9抑制后显著降低；敲减Aldh1a3抑制细胞增殖（如图5B）和克隆形成（如图5C）；如图5D，在HMM细胞中，在Aldh1a3基因转录起始位点TSS上游的53kb（region 2）和118kb（region 4）处存在两个主要的HOXA9结合位点，上游77kb（region 3）处存在较小的HOXA9结合位点，这些区域被称为DE是因为在HMM细胞中高水平的H3K4me1和H3K27ac，而MP细胞中没有；值得注意的是，在HMM细胞中相对靠近Aldh1a3基因转录起始位点区域也存在高水平的H3K4me1，但是较低水平的H3K27ac，如region 1。为确定这些增强子对于Aldh1a3基因的表达调控，研究工作者进行了4C-seq，如图5E，region 1、region 2和region 4与Aldh1a3基因TSS（viewpoint）存在远程相互作用，而region 3在HMM和MP细胞中与TSS都没有相互作用，暗示其并不参与Aldh1a3基因表达调控。为进一步确定这些区域对Aldh1a3基因的表达调控的作用，研究工作者利用CRISPR/Cas9靶向删除对应的区域，如图5F，删除region 2和region 4后显著抑制Aldh1a3基因表达。因此，HOXA9通过DE调控Aldh1a3基因表达。

5，HOXA9招募MLL3/MLL4复合体建立DE的表观遗传特征

为确定参与DE处HOXA9依赖的H3K4me1的组蛋白甲基转移酶，研究工作者在HMM细胞针对HA-HOXA9进行免疫共沉淀，然后进行质谱，分析发现，KMT2C和KMT2D（又称MLL3和MLL4）以及它们的协同因子PTIP与HOXA9存在相互作用，如图6A，PTIP以及MLL3/MLL4与HOXA9的确存在相互作用。然后，研究工作者在HMM细胞中针对MLL3/4进行ChIP-seq分析其在基因组的分布情况，如图6B，MLL3/MLL4主要富集在HMM细胞中激活的增强子，此外，约39%的MLL3/MLL4结合位点与HOXA9重合。重要的是，如图6D，HOXA9抑制导致DE处MLL3/MLL4的结合，而不影响PE处MLL3/MLL4的结合。接下来，研究工作者进一步检测特定位点HOXA9、MLL3/MLL4和CEBPα相互作用，如图6E，分别敲减Ptip（编码MLL3/MLL4复合体核心部分）和Cebpa（编码CEBPα）并不影响HOXA9在选定位点的结合。因此，HOXA9功能位于MLL3/MLL4和CEBPα的上游。

Figure 5 HOXA9可远距离调控Aldh1a3基因转录

6，敲除MLL3/MLL4复合体破坏HOXA9/MEIS1介导的白血病形成

考虑到DE以及其调控复合体MLL3/MLL4的重要功能，研究工作者提出问题，敲除MLL3/MLL4是否能封闭HOXA9/MEIS1诱导的白血病形成？如图7A，4-OHT分别处理Ptipf/f:ER-Cre+/-细胞和Ptipf/f:ER-Cre-/-细胞诱导敲除Ptip，然后移植在致死剂量辐射小鼠，敲除Ptip显著延长小鼠寿命，因此，敲除Ptip影响MLL3/4功能后延长小鼠寿命；相似地，直接敲除MLL4同样延长小鼠寿命（如图7B），但是作用不及敲除Ptip。因此，MLL3和MLL4对于在体HOXA9介导的白血病形成起着关键作用。为确定白血病细胞中DE和PE处H3K4me1变化，研究工作者在Ptipf/f:ER-Cre+/-细胞和Ptipf/f:ER-Cre-/-细胞移植30天时分离BM细胞进行ChIP-seq，如图7C，敲减Ptip减少DE处H3K4me1，但并不影响PE处H3K4me1。因此，MLL3/MLL4通过调控DE染色质构象促进白血病发生。

为进一步确定MLL3/MLL4复合体对于HOXA9/MEIS1白血病的抑制作用是否由于其对细胞生存的毒性作用，研究工作者通过细胞分离以及4-OHT处理敲除Ptip，如图7D（左侧），敲除Ptip不影响正常BM细胞的增殖以及克隆形成，如图7D（中间），敲除Ptip不仅抑制MLL-AF9细胞的克隆形成而且抑制连续接种实验时克隆恢复，如图7D（右侧），敲除Ptip仅抑制E2A-HLF细胞的克隆形成但不影响连续接种实验时克隆恢复。因此，MLL3/MLL4复合体特异性体外抑制MLL-AF9白血病。

Figure 6 HOXA9直接招募MLL3/MLL4复合体至新形成的增强子

三

讨论与思考

本文的研究发现，HOXA9通过招募MLL3/MLL4复合体建立增强子表观遗传特征，进而调控特定基因表达，更重要的是敲除Ptip破坏MLL3/MLL4复合体功能后，HOXA9白血病小鼠的寿命显著延长，这一发现提供了治疗HOXA9高表达的白血病的潜在靶点。在这一研究过程中有许多值得我们学习和思考的地方，整理如下：

1，HMM细胞中获得H3K4me1的增强子有3760个（图2C），但HOXA9结合的获得H3K4me1的增强子（DE）是764个（图3A），约3000个增强子没有检测到HOXA9结合。

这一结果提示了HOXA9对于HMM细胞中重编程增强子分布的重要作用是通过两种途径得以实现的，一是HOXA9直接在DE处的结合，招募MLL3/MLL4复合体建立增强子表观遗传特征；二是HOXA9通过调控特定基因转录间接建立DE处H3K4me1的表观遗传特征，待进一步的深入研究。

2，虽然HOXA9介导白血病细胞中DE的建立H3K4me1表观遗传特征及促进基因表达，但HOXA9过表达却导致大多数PE的H3K4me1减少和基因表达减少。

本文研究工作者推测有两种可能性：

（1）HOXA9抑制PE基因表达；

（2）HOXA9结合在PE位点后，阻止其他转录协同因子（例如MLL3/MLL4复合体）进入：本文实验证明抑制HOXA9后，PE处MLL3/MLL4复合体以及H3K4me1轻微增加，在一定程度支持了这一猜测。

以上两种推测并不矛盾，本质上都是推测HOXA9抑制PE基因表达，但其具体机制仍需进一步的深入研究。基于本文研究，我推测HOXA9在PE的结合也可能通过建立特定的表观遗传特征（例如H3K9me2/3或H3K27me3）调控基因沉默：本文研究工作者通过实验已经获得了HMM细胞中H3K27ac和H3K27me3的ChIP-seq数据以及HOXA9的质谱数据，可考虑分四步进行：

Step 1：研究工作者已经分析了HMM中整体HOXA9结合位点的表观遗传特征（图1B），我们单独分析PE和DE对应的HOXA9结合位点的表观遗传特征，看是否存在差异；

Step 2：根据HOXA9的质谱结果，分析与基因沉默相关的组蛋白修饰酶以及转录抑制因子及辅助因子，重点关注组蛋白甲基转移酶，筛选高度富集的组蛋白甲基转移酶为初步研究对象；

Step 3：在HMM细胞中，敲减Step 2中确定的组蛋白修饰酶，进行RNA-seq，分析PE相关基因的表达变化，进一步确定研究对象；

Step 4：根据Step 3中确定的组蛋白修饰酶，使用其对应的组蛋白修饰抗体进行ChIP-seq，分析PE和DE对应的HOXA9结合位点的表观遗传特征，后续课题设计参考本文进行。

Figure 7 MLL3/MLL4复合体是HOXA9介导白血病形成所必须的

3，敲除MLL4延长小鼠寿命至48天（图7B），但敲除Ptip延长小鼠寿命至70天（图7A）。

Ptip是MLL3/MLL4复合体的重要组成部分7，与敲除MLL4相比，敲除Ptip直接破坏MLL3/MLL4复合体的功能，使得肿瘤小鼠寿命延长更多，提示MLL3/MLL4协同促进HOAX9白血病发生，可通过单独敲除MLL4以及同时敲除MLL3和MLL4后检测肿瘤小鼠寿命来进一步确定。此外，Ptip可能也是靶向治疗HOXA9白血病的有效靶点，也可考虑与HOXA9靶点的联合治疗。

参考文献

Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O. & Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies.Nat Immunol17, 1016-24 (2016).

Argiropoulos, B. & Humphries, R.K. Hox genes in hematopoiesis and leukemogenesis.Oncogene26, 6766-76 (2007).

Collins, C.T. & Hess, J.L. Deregulation of the HOXA9/MEIS1 axis in acute leukemia.Curr Opin Hematol23, 354-61 (2016).

Krivtsov, A.V. & Armstrong, S.A. MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.Nat Rev Cancer7, 823-33 (2007).

Falini, B. et al. Cytoplasmic mutated nucleophosmin (NPM) defines the molecular status of a significant fraction of myeloid sarcomas.Leukemia21, 1566-70 (2007).

Huang, Y. et al. Identification and characterization of Hoxa9 binding sites in hematopoietic cells.Blood119, 388-98 (2012).

Cho, Y.W. et al. PTIP associates with MLL3- and MLL4-containing histone H3 lysine 4 methyltransferase complex.J Biol Chem282, 20395-406 (2007).