摘在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promeg
1
中国十大最贵天然奇石
1
鸡雏出壳
1.3亿元人民币
2
东坡肉
1.3亿元人民币
3
血胆金莲
1.65亿港币
4
中华神鹰
1.2亿元人民币
5
岁月
1亿元人民币
6
人之初
1亿元人民币
7
中国版图
9600万元人民币
8
藏羚羊
8000万元人民币
9
钟馗
6500万元人民币
10
中国虎
5000万人民币
2
中国十大最贵瓷器
1
元青花萧何月下追韩信梅瓶
7.1亿元人民币
2
清乾隆粉彩镂空“吉庆有余”转心瓶
5.54亿元人民币
3
元青花鬼谷子下山罐
2.3亿元人民币
4
明成化斗彩鸡缸杯
2.21亿元人民币
5
清乾隆粉彩“万寿连延”葫芦瓶
2.07亿元人民币
6
北宋汝窑天青釉葵花洗
1.74亿元人民币
7
清乾隆御制珐琅彩杏林春燕图碗
1.25亿元人民币
8
霁蓝描金开光粉彩花鸟暗刻松石
绿釉如意双耳尊民国粉彩双耳尊
1.18亿元人民币
9
清乾隆珐琅彩古月轩锦鸡图双耳瓶
0.96亿元人民币
10
清乾隆青花海水红彩龙纹
八吉祥如意耳葫芦瓶
8344万元人民币
3
中国十大最贵名画
1
齐白石 | 《松柏高立图·篆书四言联》
4.255亿元人民币
2
王蒙 | 《稚川移居图》
4.02亿元人民币
3
任仁发 | 《五王醉归图》
3.036亿元人民币
4
李可染 | 《万山红遍》
2.9325亿元人民币
5
潘天寿 | 《鹰石山花图》
2.7945亿元人民币
6
徐悲鸿 | 《九州无事乐耕耘》
2.668亿元人民币
7
傅抱石 | 《毛石三诗意册》
2.3亿元人民币
8
张大千 | 《桃源图》
2.254亿元人民币
9
吴冠中 | 《周庄》
1.97亿元人民币
10
齐白石 | 《辛未山水册(十二开)》
1.943亿元人民币
4
中国十大最贵书法
1
黄庭坚《砥柱铭》
4.37亿元人民币
2
王羲之草书《平安帖》
3.08亿元人民币
3
宋徽宗《临唐怀素圣母帖》
1.28亿元人民币
4
曾巩《局事帖》
1.08亿元人民币
5
朱熹等《宋名贤题徐常侍篆书之迹》
1.008亿元人民币
6
赵孟頫行书《洛神赋》
8008万元人民币
7
宋克《草书杜子美壮游诗卷》
6832万元人民币
8
文征明《西苑诗册页》
5208万元人民币
9
傅山草书《为毓青词丈作诗》
4872万元人民币
10
北宋曾纡《人事帖》
4592万元人民币
5
中国十大最贵名烟
1
利群—富春山居
20000元/条
2
和天下—尊尚5000
14000元/条
3
泰山—拂光 锡罐
12000元/条
4
金圣—智圣出山
10000元/条
5
黄鹤楼—流金岁月
10000元/条
6
黄金叶—天之叶
10000元/条
7
大重九—9+1
10000元/条
8
黄鹤楼—中国梦
10000元/条
9
华叶
8000元/条
10
毛氏雪茄
产品尚未上市,即有人欲以4000元/条求购
6
中国十大最贵名酒
1
1935年赖茅酒
单瓶1070万元
2
汉帝茅台
单瓶890万元
3
30年代赖茅
单瓶260万元
4
国藏汾酒
单瓶209万元
5
陶酒瓶茅台酒
单瓶184万元
6
1953年出产的“车轮牌”茅台酒
单瓶150万元
7
五星茅台
单瓶103.5万元
8
1960年五粮液
单瓶98万元
9
五粮液九十周年金奖纪念酒
单瓶88万元
10
国窖1573“叁60”
单瓶33.66万元
8
中国十大最贵茶叶
1
云南金瓜贡茶
无价,国家二级文物
2
武夷山母树大红袍
无价,珍稀茶种
3
西湖龙井御前八棵
无价,年产量只有二两
4
安徽太平猴魁
200万元/公斤
5
安徽黄山毛尖
170万元/公斤
6
河南信阳毛尖
149万元/公斤
7
潮州凤凰单丛宋种1号
100万元/公斤
8
安徽六安瓜片
92万元/公斤
9
安溪铁观音
67万元/公斤
10
贵州都匀毛尖
66.6万元/公斤
天价天价,
看完真是开眼界了!
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