从Cell上的乳腺癌研究中，我们能学到哪些套路

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DNA损伤修复的新帮手——NUMB

乳腺癌（Breast cancer, BC）在世界范围内是女性患癌的首要类型，占癌症患者中的25%。根据乳腺癌细胞受体类型，可以将乳腺癌大致划分为雌激素阳性（estrogen receptor, ER+），孕激素阳性（progesterone receptor, PR+），人类表皮生长因子受体2阳性（human epidermal growth factor receptor, HER2+）和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer）。对前三者乳腺癌患者应用相应的抗激素治疗后预后良好，但三阴性乳腺癌因为没有3类受体中的任何一类，预后较差，因而也是研究者们主要的研究对象。

在Cell上一篇题为“Inadequate DNA Damage Repair Promotes Mammary Transdifferentiation, Leading to BRCA1 Breast Cancer”的研究中，作者聚焦BRCA1缺失的乳腺癌（大多数都是三阴性乳腺癌），找到了一个新的与BRCA1结合的蛋白NUMB，并进一步探究了其在乳腺癌发展过程中的生物学功能及机制，丰富了对BRCA1乳腺癌的了解。

首先，已有研究表明BRCA1编码的蛋白p220在DNA修复中发挥作用，而BRCA1的C端（BRCT）区域对于p220发挥DNA修复功能至关重要。在BRCT中，存在两段相邻的重复序列作为DNA修复的信号受体，这两段序列均包括一段保守的pSXXF / pSRTF序列，已知的3个BRCA1结合蛋白CtIP，BACH1/BRIP1，Abraxas都包含这段保守序列。

在此基础上，作者在数据库中检索了包含SPTF序列但还未被发现的与BRCA1结合的多肽，找到了一个与干细胞生物学相关的蛋白——NUMB。恰巧的是，NUMB是维持乳腺上皮细胞（MEC）分化所必需的。当然，这里的NUMB也可以换成数据库中另外的分子，就又是新的研究。

随后，作者通过免疫共沉淀实验证明了BRCA1与NUMB的直接结合（Fig.1A, 1B），并进一步通过BRCA1序列分段找到了其与NUMB结合的区域（F6: aa 1314-1863）（Fig.1G）。此外，由于NUMB存在两个亚型，分别是long和short，作者同样分别进行了免疫共沉淀检测。

在已知的3个BRCA1结合蛋白的SPTF序列中，丝氨酸被ATM/ATR磷酸化以稳定它们与BRCA1的结合。为了验证NUMB是否有同样的性质，作者设计了NUMB的突变体（NUMB 2A），结果显示突变体无法与BRCA1结合（Fig.1H），同时使用ATM抑制剂后检测BRCA1和NUMB的结合（Fig.1E），同样表明抑制ATM后，BRCA1-NUMB结合受到干扰，从而验证了猜想。

Fig.1 NUMB Is a BRCA1 Partner

在Fig.2中，作者首先进行了NUMB在细胞中的定位研究。通过免疫荧光检测（Fig.2B），作者发现NUMB在细胞质和细胞核中都存在，且与BRCA1共定位。在低表达CD44的MECs中，作者通过免疫荧光检测发现NUMB通常都与BRCA1和53BP1共定位于G0/G1期细胞中（Fig.2A-2D）。

此外，作者也通过对cyclin A和53BP1的免疫荧光结果发现，敲低NUMB后，53BP1表达上调（Fig.2E, 2F）。53BP1主要在G1期和S/G2期发挥稳定非同源末端结合并抑制同源重组驱动的DNA双链断裂修复的功能。这表明敲低NUMB后，DNA修复将更加难以完成。

为更加充分地论证BRCA1，NUMB，53BP1三者的关系，作者通过添加ATM抑制剂KU55933证明抑制磷酸化过程会抑制NUMB与53BP1的结合，同时，53BP1的缺失影响了BRCA1和NUMB的共定位（Fig.2J, 2K）。

Fig.2 NUMB-BRCA1 Colocalization

前边我们说到BRCA1参与了DNA的损伤修复，已有研究表明，BRCA1及其结合蛋白FANCD2和BRG1参与了ICL修复。作者提出NUMB可能也参与ICL修复的猜想并进行了进一步论证。

首先作者发现缺失NUMB后，无论是低表达CD44或初始MCF10A MECs都表现出对ICL诱导剂顺铂和丝裂霉素C的高敏感性（Fig.3A-3D）。随后，作者通过构建抗NUMB siRNA的NUMB表达载体进行了Rescue实验，表明NUMB对ICL修复是必要的（Fig.3C, 3D）。

还记得酸菜实验口诀的前半句吗，正反回复。

从前边的结果我们知道BRCA1和NUMB是共定位的，那么二者结合是否具有协同作用呢？作者在Fig.3E-3G中给出了答案，结果表明BRCA1和NUMB在ICL修复上具有协同作用。

由于缺乏ICL修复严重威胁了低表达CD44 MECs的分化状态，那么NUMB对于维持低表达CD44 MECs的分化状态是否为必要的呢？Fig.3J的结果显示，在低表达CD44的细胞经历EMT时，NUMB发生了亚型转变，其中long亚型减少，short亚型增多。作者通过设计long亚型的特异性siRNA和short亚型的表达载体进行进一步验证，发现当单独沉默long亚型或单独过表达short亚型时，不能引起显著的EMT，而当两者同时进行时，就会出现显著的EMT（Fig.3K）。

Fig.3 NUMB and MEC Differentiation

NUMB参与ICL修复和维持MECs分化的发现引发了作者对Notch通路作为后者基础的思考，更重要的是，Notch通路的转录因子HES1对于恰当的ICL修复是必要的。同时，实验结果表明HES1的缺失同样会导致低表达CD44表现出对ICL诱导剂顺铂和丝裂霉素C的高敏感性（Fig.4A-4C）。

既然NUMB，BRCA1和HES1的功能有相似之处，那么三者的关系也就成了接下来要完成的重要工作。作者再次通过免疫共沉淀，证明了NUMB，BRCA1，FANCD2和HES1的结合（Fig.4D, 4E），ATM抑制剂同样干扰了NUMB-HES1的结合。

同时，在Fig.4G中，作者通过分别缺失NUMB和HES1证明BRCA1，NUMB，HES1组成复合体参与ICL修复，任何一者的缺失都会影响复合体稳定性。

Fig.4 HES1 Facilitates BRCA1/NUMB Dependent ICL Repair

找到了新的BRCA1结合蛋白NUMB，同时也通过免疫共沉淀阐明了BRCA1，NUMB和HES1的关系之后，作者回到了表型相关的研究上。

接下来也就是口诀的后半句，细胞动物。

为探究BRCA1缺失如何影响luminal MEC的命运并促进乳腺癌的发展，作者通过注射Ad-K8-Cre构建了小鼠BRCA1乳腺癌模型，用YFP标记了MECs。Fig.5B和5C的结果表明，缺失BRCA1之后，basal-like乳腺癌细胞数量显著增加，表明BRCA1缺失促进了乳腺癌由luminal向basal的转化。

GSEA数据库比对结果表明，小鼠BRCA1缺失肿瘤与人basal-like乳腺癌亚型，小鼠MycEx，p53null-Basa-IEx，C3TagEx亚型同属于basal-like乳腺癌（Fig.5F）。最后，基因集分析结果表明BRCA1缺失导致luminal来源的MECs获得了基底样和间质样的基因表达而表现出EMT进程。

Fig.5 BRCA1 Loss in Luminal MECs Promotes Development of Basal-like Mammary Tumors

为进一步阐明BRCA1缺失引起luminal到basal的转变。作者从小鼠体内分离出肿瘤细胞，进行了RNA-seq分析，结果表明与EMT相关的bio-markers均显著上调（Fig.6A），进一步的GSEA分析结果表明，仅在p53/BRCA1组中出现了EMT相关基因集的富集（Fig.6B）。

在Ex vivo水平上，作者发现BRCA1/p53双缺失的类器官形成效率和大小大于p53单独缺失，类器官组织中basal & mesenchymal基因表达上调只存在于BRCA1/p53双缺失组（Fig.6C, 6D）。以上结果表明，BRCA1功能缺失会引起luminal到basal的转变。

为了更加充分的在体内水平上说明这个过程，作者还进行了单细胞RNA-seq分析。从Fig.6E, 6F的结果中可以看到，BRCA1和p53缺失后，HR-LP细胞（HR：激素受体；LP：luminal祖细胞）是主要的MECs成员。YFP+-p53/BRCA1缺失LPs和basal-like细胞持续经历EMT转变。

在对于两个肿瘤的分析中，作者发现了1-2簇肿瘤上皮细胞和1簇间质样细胞（Fig.6G, 6H）。肿瘤上皮细胞很大程度上反映了它们来源于LPs，因为它们表达LP/肺泡腔luminal基因，例如Sox9, Csn3, Wfdc18, Lcn2, Mfge8, Phlda1, Tm4sf1, Fxyd3。这些簇中的很多细胞也表达了间质化和EMT介导基因，例如Sox4，表明它们正在经历EMT。

为了探究在BRCA1/p53缺失MECs中，细胞命运是否与DNA损伤积累相关，作者给来源于注射了Ad-K8-Cre的PBY雌鼠的乳腺组织染色，通过检测53BP1作为DNA损伤积累的bio-marker。结果发现随着注射后的时间延长，53BP1阳性细胞数量显著增加。

以上这些结果表明，BRCA1维持的luminal MECs正常分化是basal-like乳腺癌发展的主要抑制因子。而在p53缺失背景下的BRCA1缺失会导致luminal MECs异常分化、孕激素非依赖性、高增殖能力、basal & mesenchymal细胞的发生。

Fig.6 Loss of BRCA1 Function Elicits a Luminal to Basal/Mesenchymal Fate Change and Accumulation of DNA Damage

为进一步验证BRCA1 DNA修复缺失是否会导致异常的MEC转分化，作者用顺铂处理离体组织，免疫荧光检测了53BP1和K5的检测，结果显示顺铂处理的basal-like类器官细胞中的K5显著上调（Fig.7A）。

此外，作者还检测了basal & mesenchymal相关的bio-markers，发现顺铂处理组与对照组相比有显著上调。在组织大小方面，BRCA1缺失和NUMB缺失都导致了组织大小显著增加。同样NUMB缺失对于basal & mesenchymal相关的bio-markers的上调效果也与缺失BRCA1相同。

此外，无论BRCA1还是NUMB的缺失都导致了异常分化的MECs中DNA损伤的积累。以上结果表明，NUMB与BRCA1缺失都能够使DNA损伤无法修复而积累，进而导致异常的MEC分化，最终形成肿瘤。

总结全文，作者首先通过数据库发现了BRCA1的新结合蛋白NUMB，通过荧光标记，作者证明了核NUMB是BRCA1的伴侣蛋白。随后，作者通过NUMB敲除，证明了NUMB参与ICL修复。

同时也发现了在EMT过程中，NUMB会发生亚型转化，long亚型减少，short亚型增多。由于HES1是ICL修复中的重要蛋白，所以作者通过一系列实验证明HES1与BRCA1，NUMB的结合和相互作用，以及HES1在MECs转分化中的功能。

作者将BRCA1-NUMB-HES1复合体阐述清楚后，回归表型研究，探究luminal MECs向basal-like MECs的转化过程中上述几个分子的作用。作者在细胞水平和离体组织水平上进行了BRCA1敲除，表明BRCA1的缺失会导致luminal MECs向basal-like MECs的转化。

同时，作者还发现BRCA1的缺失会导致DNA损伤的积累，而这种损伤的积累会导致MECs的异常转分化。至此，作者完成了发现NUMB，验证NUMB功能及机制，探究BRCA1-NUMB如何影响MECs转分化的过程。

参考文献：

Inadequate DNA Damage Repair Promotes Mammary Transdifferentiation, Leading to BRCA1 Breast Cancer

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