nanopore测序技术专题：fastq文件探索

得到fastq格式的nanopore测序数据就可以开始分析了，但是先别急，我们需要先对fastq格式文件进行一下处理，先不要着急拿过来就开始分析，我见过很多人，拿过来数据之后就开始做拼接，然后就等着错误的结果，然后在使用更多时间来找原因。心有猛虎，也要细嗅蔷薇。

fastq文件格式

fastq格式是一种包含质量值的序列文件，其中的q为quality,一般用来存储原始测序数据，扩展名一般为fastq或者fq。目前illumina测序，BGISEQ，Ion Torrent，pacbio，nanopore都以fastq格式存储测序数据，其中illumina，BGISEQ一般是双末端测序，一般是一对文件，命名为_R1.fq.gz与_R2.fq.gz。下面是fastq格式常见的序列格式。

第一行：以‘@’开头，是这一条read的名字，这个字符串是根据测序时的状态信息转换过来的，中间不会有空格，它是每一条read的唯一标识符，同一份FASTQ文件中不会重复出现，甚至不同的FASTQ文件里也不会有重复；

第二行：测序read的序列，由A，C，G，T和N这五种字母构成，这也是我们真正关心的DNA序列，N代表的是测序时那些无法被识别出来的碱基；

第三行：以‘+’开头，在旧版的FASTQ文件中会直接重复第一行的信息，但现在一般什么也不加（节省存储空间）；

第四行：测序read的质量值，这个和第二行的碱基信息一样重要，它描述的是每个测序碱基的可靠程度，用ASCII码表示。

质量值体系

上面提到fastq格式中的q代表质量值，因此fastq格式中质量值具有重要的作用，在很多的分析中会用到这个质量值，例如数据质控，数据过滤，序列拼接，短序列比对，变异检测中都要用到这个质量值。

图2 Phred质量值

这个质量值是基于phred质量值体系，但是由于单个碱基无法与两位的质量值相匹配，例如A碱基对应的质量值为40，一个A字符对应两个字符40，因此需要将原始质量值加上33或者64，在转换为对应的ASCII码值，为何加33，因为33以下ASCII码无法用键盘字符表示出来。illumina测序1.8版本以上加33，以下加64。

软件安装

处理fastq格式文件可以使用seqkit和seqtk工具，这两个小工具类似，seqkit功能更多一些，可以处理fastq和fasta格式，非常方便，可以说是序列处理的“瑞士军刀，可以使用bioconda进行安装；

fastq文件格式处理案例

案例一：合并guppy结果

案例二：压缩与解压缩

案例三：文件统计

案例四：排序

案例五：过滤短的序列

案例六：质量值转换

案例七：抽样

案例八：拆分数据

案例九：转换为fasta

案例十：截取部分

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