4+分的Aging现在得补这么多湿实验了！

今天和大家分享的是2020年发表在 Aging（IF：4.831) 上的一篇文章，“Elevated lymphocyte specific protein 1 expression is involved in the regulation of leukocyte migration and immunosuppressive microenvironment in glioblastoma ”。作者使用CGGA和TCGA的数据，分析GBM中白细胞迁移相关基因的表达，发现LSP1不仅表达升高，而且还作为GBM的独立预测因子，在临床肿瘤样本中进一步验证了该结果。此外，通过KM生存分析得：LSP1的表达与GBM肿瘤对放疗和化疗的反应密切相关；并通过功能基因富集分析和MCP-counter分析得：LSP1有助于GBM的肿瘤免疫抑制微环境。

Elevated lymphocyte specific protein 1 expression is involved in the regulation of leukocyte migration and immuno suppressive microenvironment in glioblastoma

胶质母细胞瘤中LSP1的高表达与白细胞迁移和免疫抑制微环境的调节有关

一、 研究背景

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，手术，放疗和化疗的效果都不理想。肿瘤微环境（TME）的免疫抑制和冷表型（相对较少的淋巴细胞浸润）已被确定为GBM进展和复发的关键因素。靶向基因间质的成分，并降低这些因子引起的免疫抑制作用有望为患者创造新的治疗机会。

二、 分析流程

三、 结果解读

1. LSP1是胶质母细胞瘤的独立危险因素

白细胞迁移在全身免疫细胞的分布中起到关键作用。作者在补充材料表1和2中总结了白细胞迁移相关基因的列表，并分析了这些基因与临床病理特征之间的相关性。发现大多数白细胞迁移相关的基因与胶质瘤的纯度显著相关。

• 1A和B：热图描述了在CGGA（A）和TCGA（B）数据库中，GBM中白细胞迁移相关基因的表达与肿瘤纯度，免疫和基质得分以及IDH1状态之间的相关性。

作者将上述基因在低级别神经胶质瘤（LGG）和GBM中的表达模式进行比较。使用CGGA和TCGA数据库的RNA测序数据进行分析。发现LSP1是白细胞迁移相关基因中唯一的基因，在胶质瘤中不仅表达升高，还与不良预后有关。

• 1C和D：火山图展示了在CGGA（A）和TCGA（B）数据库中，GBM和LGG之间差异表达的白细胞迁移相关基因。在两个数据集中有61个重叠的差异表达基因，结合补充表1和2的白细胞相关基因，在补充表4中展示了8个重叠基因。
• 1E-H：KM生存分析，展示了LGG和GBM中LSP1高表达和不良结局之间的关联。

图1：LSP1作为白细胞迁移相关基因，在神经胶质瘤中表达升高，且与不良预后有关

由于在不同等级中，神经胶质瘤的分子性质有显著的异质性。作者根据2016 WHO等级系统对LSP1的表达进行分析。

• 2A和B：II和III级神经胶质瘤相比，GBM（IV）中LSP1表达显著增加。
• 2C-E：qPCR，WB和IHC在临床神经胶质瘤样本中验证，得到类似的结果。
• 补充材料2B：LSP1高表达的肿瘤周围的良性组织的LSP1表达水平明显低于肿瘤组织。
• 2G：免疫荧光共定位：GBM样品中有少量细胞与LSP1和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共同染色，这提示GBM中肿瘤细胞相关的LSP1表达。
• 2F：KM生存分析曲线，评估LSP1表达与GBM患者预后的相关性。发现，较高的LSP1表达与GBM患者的较短生存期有关。

图2：根据WHO等级，GBM亚型和IDH1突变状态分析LSP1的表达

2. GBM的IDH1野生型和间充质亚型中的LSP1高表达

已知IDH1突变是低级神经胶质瘤（LGG）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）的较好预后的稳定指标。突变型的神经胶质瘤可能会导致与野生型不同的特性，因此，作者比较了IDH1突变和野生型之间的LSP1表达。这些发现表明LSP1在GBM中表达升高，尤其是在IDH1野生型和间充质亚型肿瘤中，提示预后不良。

• 2H和I：IDH1野生型的GBM中，LSP1表达显著上调。表明升高的LSP1表达在IDH1野生型胶质瘤中更常见。
• 2J和K：间充质亚型GBM的LSP1表达水平高于其他三种亚型（proneural，Classical和Neuros）
• 补充材料2：ROC曲线和AUC值来验证LSP1作为间充质GBM的标志物的敏感性和特异性。结果证实了LSP1在GBM中区分间充质亚型的潜力。

3. LSP1可作为预测GBM的放射治疗和化学治疗反应的分子。

先前的研究表明，在乳腺癌和霍奇金病等恶性肿瘤中，LSP1的表达与促进化疗和放疗的耐药过程有关。作者进行多变量COX回归和KM生存分析，验证LSP1是否可以作为预测GBM患者对放疗和化疗反应的标志物。

• 补充表6：多元Cox回归分析的结果表明，LSP1的表达与放疗和化疗的GBM患者的生存率显着相关

根据治疗策略（是否接受放疗）和LSP1表达（高/低），作者将CGGA和TCGA中的样品分为四组。

• 3A和B：KM生存绘图：无论GBM患者的LSP1表达如何，接受放疗的患者的生存时间长于未接受放疗的患者。 但是在接受放疗的GBM患者中，低LSP1组更有优势。对于没有接受放疗的患者而言则没有明显差异。 这表明，LSP1可能参与介导GBM患者放疗的耐药性。

MGMT启动子甲基化是TMZ化疗治疗的GBM患者的预测指标。其未甲基化水平越高，TMZ耐药。根据MGMT启动子甲基化状态和LSP1的表达，将TCGA样本分为三组（高甲基化水平的高/低表达LSP1组，未甲基化组）

• 3C：KM生存分析绘图的结果表明，与具有甲基化的高LSP1表达组（红）相比，低表达组（蓝）有生存优势。相反，未甲基化的MGMT启动子（绿）与高表达LSP1的甲基化组（红）之间没有生存率差异。 这表明高LSP1表达可以抵消MGMT启动子甲基化的预后优势。
• 3D：在化疗组的患者中，具有甲基化MGMT启动子的高LSP1表达组（红）与未甲基化组（绿）相比，没有明显的生存优势。 这表明，LSP1介导的化疗耐药可能与MGMT启动子甲基化密切相关。

图3：LSP1可以作为预测GBM中放疗和化疗反应的分子

4. 功能基因分析显示，LSP1与免疫事件相关

接下来，作者重点研究LSP1在GBM中的功能。在补充表7中展示了与LSP1表达正相关的基因列表。根据该基因列表进行GO,GSVA和GSEA分析。

• 4A和B：GO分析的结果。描述了与GBM中LSP1阳性相关基因的生物过程。结果表明，与LSP1最相关的基因主要参与白细胞迁移，免疫反应和炎症反应的调控。 在补充材料中展示了，与LSP1表达负相关的基因则有助于调节正常的生物学过程，例如大脑和脊髓的发育。
• 4C和D：展示了GSVA的结果，表明在具有高LSP1表达的样本中，白细胞迁移，炎症反应，和免疫反应表型的富集。
• 4E：GSEA结果表明，LSP1高表达的GBM中白细胞迁移显著增强。
• 4F：KEGG通路分析：LSP1与免疫相关通路显著相关。例如白细胞跨内皮迁移，NF-κB信号通路，细胞因子-细胞因子受体相互作用和原发性免疫缺陷。

这些发现表明，LSP1可能在调节GBM的免疫生物学过程中起重要作用。

图4：功能富集分析显示LSP1与免疫事件相关

5. LSP1高表达伴随GBM的巨噬细胞，中性粒粒细胞和Treg细胞浸润增加

胶质瘤的TME包含非癌细胞（免疫细胞和基质细胞），他们可能通过与TME中的胶质瘤细胞发生广泛的串扰来促进肿瘤进展并介导耐药性。

• 5A和B：通过MCP-counter分析GBM中LSP1表达与非肿瘤免疫细胞的基质细胞群体的相关性。发现，LSP1表达与细胞毒性淋巴细胞强烈负相关。与B细胞谱系，单核细胞系，嗜中性粒细胞和成纤维细胞正相关
• 5C和D：GSVA分析，进一步探索LSP1与TME中不同非肿瘤细胞群体之间的关系。结果表明，LSP1与细胞毒性淋巴细胞呈负相关，与Treg，嗜中性粒细胞和巨噬细胞，尤其是M2巨噬细胞呈正相关。

先前的研究显示，巨噬细胞和中性粒粒细胞提示神经胶质细胞瘤患者预后不良。作者对29个临床样本的LSP1，IBA1（巨噬细胞标志物）和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（嗜中性粒细胞标志物）进行了IHC染色。

• 5E和F：IHC图像和分析结果：在LSP1高表达的GBM组织中，巨噬细胞和嗜中性粒细胞高度浸润；在LSP1低表达的GBM组织中，巨噬细胞和中性粒细胞低浸润。
• 5G和H：免疫荧光共定位结果，证实LSP1在GBM组织中的中性粒细胞和巨噬细胞中表达。

在补充材料5中，作者研究了神经胶质细胞瘤细胞和非肿瘤细胞中LSP1的表达水平。结果表明，LSP1主要与GBM中的非肿瘤细胞群体有关。基于此观察，作者研究了THP1诱导的M0巨噬细胞中LSP1对GBM迁移能力的影响。

• 5I和J：WB（I）和Transwell分析（J），显示LSP1的敲减抑制了M0巨噬细胞的迁移，而LSP1的过表达增强其迁移。

图5：LSP1的高表达有助于GBM中的免疫抑制微环境

6. 免疫抑制基因和LSP1的表达上调是GBM的主要特征

基于上述结果，作者研究了GBM中LSP1表达与免疫抑制基因之间的相关性。

• 6A：韦恩图，展示t检验得到的：CGGA，TCGA，免疫抑制基因组中与LSP1高表达有关的10个重叠免疫抑制基因。
• 6B和C：LSP1与GBM中上述10个免疫抑制基因的Pearson相关性分析。表明LSP1与以下分子之间具有强相关性，包括OSM，OSMR，PD1，CD86，HAVCR2，LAIR1，LILRA2，LILRA6，LILRB1和LILRB3。这与在4F中展示的LSP1富集免疫相关通路（细胞因子-细胞因子受体）相匹配。
• 6D-K：KM生存分析曲线，表明：LAIR1，OSMR，PD1和LILRB3与LSP1结合，在GBM的CGGA和TCGA数据集中有预后价值。
• 6L：由于PD1，LARI1和OSMR在免疫抑制微环境中的重要作用，作者进一步研究了这些分子在临床组织中的WB图像。
• 6M-O：对临床组织中LSP1与PD1（M），LAIR1（N），OSMR（O）WB的结果进行Pearson相关分析。发现与LSP1的表达与这些基因存在相关性。
• 6P：WB图像展示LSP1过表达显著增加了THP-1细胞诱导的M2巨噬细胞中PD1和LAIR1的表达。

这些数据进一步支持LSP1在GBM的TME中免疫应答调节起到关键的作用。

图6：免疫抑制基因和LSP1的表达上调是GBM的主要特征

小结

作者使用TCGA，CGGA和临床样本的数据，揭示了与LGG相比，GBM中LSP1的表达量更高，且LSP1的高表达与患者的不良预后有关。同时LSP1还可以作为GBM患者对放疗和化疗反应的预测因子。作者还展示了LSP1在GBM局部免疫反应调控中未被定义的作用，与免疫抑制细胞群呈正相关，还增强了巨噬细胞中免疫抑制相关基因的表达。总的来说，该研究表明LSP1有助于GBM中的免疫抑制微环境，并可作为其潜在的治疗靶点。