今天和大家分享的是2020年7月发表在International journal of cancer(IF:5.145)上的一篇文章,作者通过单细胞测序技术和聚类分析、功能富集分析、预后分析等多种方法探究了喉鳞状细胞癌的细胞异质性,鉴定并验证了与预后相关的几种肿瘤细胞及其标志基因。
一、研究背景
喉鳞状细胞癌(LSCC)是呼吸系统的恶性肿瘤,在头颈部鳞癌(HNSCC)中死亡率和发病率最高,约60%的患者在诊断时已经患有晚期疾病。LSCC的主要治疗方法是手术、化疗和放疗,尽管在过去十年中治疗技术已有很大改善,但仍不尽人意,肿瘤异质性可能是无效治疗的重要原因,在细胞水平了解LSCC的组成和分子特征可能有助于解决此问题。在此之前,LSCC的分子研究仅停留在不同级别的肿瘤和正常组织的比较中,较少涉及肿瘤内的异质性。本研究中作者使用单细胞测序技术(scRNA-seq)进行研究,为深入理解LSCC肿瘤内异质性提供了基础。
二、分析流程
三、结果解读
两例中高分化LSCC样本来自两名未经临床治疗的男性患者(66岁和64岁),从右声带切除2cm3的肿瘤组织,一半进行scRNA-seq,一半处理为FFPE切片进行免疫组化(IHC)染色。p16INK4a染色结果显示两例样本均为HPV阴性。
scRNA-seq流程:
使用Seurat包分析测序数据:预处理过滤基因数量少于200的细胞,选择前2500个高度可变的基因进行PCA主成分分析和t-SNE算法进行数据降维,评估前50个主成分进行两阶段的聚类。
图1a-f:LSCC细胞在整体,免疫和癌症视野中的T-SNE图及基因表达特图。
图1g:LSCC组织的细胞组成
图1h:癌细胞簇的伪分化轨迹
接下来作者对每一细胞簇进行分析,通过Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因,按照logFC排序,选择top50的基因进一步进行GO、KEGG和Reactome功能富集,并且通过WGCNA鉴定共表达标志基因。对于肿瘤细胞簇的标志基因,使用TCGA数据库的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)样本进行了生存分析。通过分析配受体对列表,作者还探究了正常,肿瘤及免疫细胞之间的相互作用。以下为免疫及肿瘤细胞簇的详细结果。
图2a中突出显示了每个免疫细胞簇的t-SNE图,共表达标志基因和GO功能富集结果,包括生物学过程(BP),细胞成分(CC)和分子功能(MF)。图2b为正常,免疫和肿瘤细胞之间配受体对相互作用数的热图。
值得注意的是,样本中巨噬细胞高表达CXCL8且主要为M2型(标记CD163),并且在免疫细胞中,巨噬细胞与其他细胞(成纤维细胞,T细胞,肿瘤细胞和巨噬细胞自身等)之间的相互作用最为活跃。与作者先前的研究结果一致,HPV阴性HNSCC组织中多为M2巨噬细胞,可能通过高表达CXCL8影响免疫逃逸。
图2a:免疫细胞簇的t-SNE图,共表达标记基因和GO富集
图2b:正常,免疫和肿瘤细胞之间的配体-受体相互作用数热图
图3a突出显示每个肿瘤细胞簇的t-SNE图,伪分化轨迹分布,共表达标记基因和GO功能富集结果。
伪分化轨迹表明,主轨迹分支有两个方向D1、D2,增殖性肿瘤细胞主要位于轨迹的起点,而永生肿瘤细胞和角质形成细胞样肿瘤细胞分别位于单独的D1、D2分支,转移肿瘤细胞则沿着起点到终点(D2)分布。
图3b显示了使用scran R分析得到的细胞周期阶段scran得分热图和每个阶段中的细胞比例。增殖性肿瘤细胞在G2 / M期的比例高于其他簇细胞,而角质形成细胞样肿瘤细胞大多在G1期。
图3:肿瘤细胞簇的t-SNE图,伪分化轨迹,共表达,GO富集和细胞周期分析结果
图4a,b:角质形成细胞样和增生性肿瘤细胞中标志基因的t-SNE图
对五个细胞簇标志基因的生存分析结果显示,以标志基因中位表达量分组的样本具有显著的组间生存差异,其中角质形成细胞样肿瘤细胞特异性表达的SPRR3,SPRR1A和SPRR2A与较好的预后有关,而增殖性肿瘤细胞特异性表达的TPX2,CKS1B和MKI67则与不良预后有关,其他三个细胞簇的标志基因均未显示出显著性。
作者还分析了这些标志基因与TCGA-LSCC肿瘤等级之间的相关性,结果显示增殖性细胞的标志基因MKI67,TPX2,TK1,CDCA3和HMGB1与肿瘤等级显著正相关,而SPRR家族基因与肿瘤等级呈负相关。
图4c,d:标志基因表达量分组的TCGA-HNSCC生存分析
图5a:标志基因与TCGA-LSCC肿瘤等级的相关性
最后作者比较了HE染色、SPRR3蛋白和Ki67(MKI67)的IHC染色的结果,定位不同肿瘤细胞簇的位置。HE显示肿块可以划分为四个部分:角化珠(CP),肿瘤核心(TC,肿块的主体),边缘区(E,edge)和边沿(M,margin),肿块由肿瘤相关成纤维细胞形成的包膜包裹。
SPRR3蛋白在部分细胞的胞质和胞核中观察到强阳性染色,这些细胞的细胞直径约为27μm,细胞核直径约为8μm,大于E区域的细胞直径,仅分布在TC区域内且集中于CP周围。表明角化细胞样肿瘤细胞位于肿瘤中心,可能与细胞角质化有关,并可能进一步分化为CP的一部分。
Ki67(MKI67)染色呈阳性的细胞主要集中在E区域,以不同的细胞核直径(4-15μm)分散分布,表明这些增殖性肿瘤细胞位于肿瘤边缘,可能处于分裂阶段,与增殖有关。
以上,角质形成细胞样细胞和增殖性细胞在肿瘤组织中呈现出独特的空间位置,作者在图6中展示了肿瘤组织中所有细胞的空间分布模型。
图5b:LSCC组织中的HE染色,Ki67和SPRR3的IHC染色
图6:细胞的空间分布模型
小结
本文是通过scRNA-seq探索LSCC组织肿瘤内异质性的第一项研究,有助于后续研究进行预后标志物的鉴定和更全面地理解肿瘤异质性。通过t-SNE降维聚类和特征基因的分析,作者鉴定并验证了LSCC组织中的多个细胞簇,包括肿瘤细胞,免疫细胞,上皮细胞,成纤维细胞和内皮细胞,进一步的分析细致研究了肿瘤细胞内的异质性,定义了具有特定空间分布的角质形成细胞样肿瘤细胞和增殖性肿瘤细胞,功能富集分析、WGCNA和TCGA生存分析显示,这两类细胞与角质形成和恶性增殖有关,并且分别与较好及不良预后相关。